楊小林，陳 平

(武漢工業(yè)學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023)

竹節(jié)參為五加科人參屬多年生草本植物Panax japonicus C.A.Mey的干燥根，原是一種名貴的民間中草藥，現(xiàn)已收載于《中華人民共和國(guó)藥典》[1]，藥用功能類似人參和三七。竹節(jié)參含有多種皂苷、糖類、揮發(fā)油和多種氨基酸。本課題組從竹節(jié)參中分離到竹節(jié)參總皂苷和多糖成分，并采用四氯化碳肝損傷小鼠模型[2]，以谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化為指標(biāo)，首次研究了竹節(jié)參總皂苷和多糖成分修復(fù)肝損傷的藥理活性。

1 材料

1.1 儀器

DG5033A型酶標(biāo)儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限公司)、TGL-16型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)、LXJ-Ⅱ離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)、Satrious電子天平(德國(guó))、恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠)、移液槍等。

1.2 藥品及試劑

聯(lián)苯雙酯片(江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司，批號(hào)0811161)，辛伐他汀片(上海信誼萬(wàn)象藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)080201)，血脂康膠襄(北京北大維信生物科技有限公司，批號(hào)20080708)，四氯化碳 (CR，北京市新光化學(xué)試劑廠生產(chǎn))，花生油(食用油，山東玉皇糧油食品有限公司生產(chǎn))，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)臨床診斷試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所，批號(hào)20090401)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)臨床診斷試劑盒(上海科欣生物技術(shù)研究所，批號(hào)20090301)，竹節(jié)參藥材經(jīng)武漢工業(yè)學(xué)院陳平教授鑒定為五加科人參屬竹節(jié)參(Panax japonicus C.A.Mey)，竹節(jié)參多糖(D1)、竹節(jié)參總皂苷(Z1)為本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠，體重18 g～22 g，雌雄各半，健康狀況良好，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，鄂醫(yī)動(dòng)管證字19-052，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均食用全價(jià)混合飼料，自由攝食、取水。

2 方法

2.1 竹節(jié)參總皂苷和多糖的制備

竹節(jié)參總皂苷的制備:取竹節(jié)參粗粉，加入10倍量60%的乙醇，浸泡2h，水浴回流提取2h，濾過(guò)得濾液。藥渣再用10倍量60%的乙醇回流提取2次，每次2h濾過(guò)。合并3次濾液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，配制成藥材:藥液(g/ml)為1∶1的溶液。上已處理好的HPD-100大孔樹(shù)脂柱，依次用水、60%的乙醇洗脫。合并60%的乙醇洗脫液，回收溶劑至近干，經(jīng)65℃減壓干燥得到竹節(jié)參總皂苷。

竹節(jié)參多糖的制備:取竹節(jié)參粗粉加入10倍量的水，浸泡2h，直火煎煮提取1.5h濾過(guò)得濾液。藥渣再用10倍量的水直火煎煮提取2次，每次1.5h，濾過(guò)。合并3次濾液，減壓濃縮至體積適量。加乙醇至濃度為70%進(jìn)行醇沉，室溫下放置12h以上，濾過(guò)并收集沉淀物，經(jīng)65℃減壓干燥得到竹節(jié)參多糖。

2.2 實(shí)驗(yàn)樣品液的配制

配制濃度為0.5%的CMC-Na水溶液;配制濃度為10mg·ml－1陽(yáng)性對(duì)照藥聯(lián)苯雙酯水溶液;配制濃度為0.05g·ml－1陽(yáng)性對(duì)照藥血脂康 CMC-Na溶液;配制濃度為0.0007 g·ml－1陽(yáng)性對(duì)照藥辛伐他汀CMC-Na溶液;配制濃度為 0.03 g·ml－1、0.015 g·ml－1竹節(jié)參多糖高、低劑量的CMC-Na溶液;配制成濃度為0.03 g·ml－1、0.015 g·ml－1竹節(jié)參總皂苷高、低劑量的 CMCNa溶液。

2.3 肝損傷實(shí)驗(yàn)方法

取昆明種小鼠108只，體重18g～22g，雌雄各半，隨機(jī)分成9組，每組12只，分為空白對(duì)照組、高脂模型組、聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組、辛伐他汀陽(yáng)性對(duì)照組、血脂康陽(yáng)性對(duì)照組、竹節(jié)參總皂苷高、低劑量組，竹節(jié)參多糖高、低劑量組。灌胃給藥?？瞻讓?duì)照組和高脂模型組每日按0.2ml/10g灌胃0.5%CMCNa，各給藥組每日灌胃給予0.2ml/10g體積的相應(yīng)藥物，給藥劑量分別為0.2g/kg、0.014g/kg、1g/kg、0.6g/kg、0.3/kg、0.6g/kg、0.3g/kg，共給藥6d。最后1次給藥2h后，除空白組外其余8組均腹腔注射0.1%的四氯化碳花生油溶液0.1ml/10g。禁食 16h，于小鼠眼底靜脈叢采血約0.5ml，分離血清(4000rp/min，10min，4℃)，室溫放置10min，利用試劑盒測(cè)定各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清的OD值，測(cè)定波長(zhǎng)為505nm得各樣品吸光度，查吸光度-卡門氏單位曲線，求得相應(yīng)的AST/GOT、ALT/GPT活力值。

3 結(jié)果(表1)

表1 肝損傷小鼠血清ALT、AST的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表(n=10，SD)

表1 肝損傷小鼠血清ALT、AST的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表(n=10，SD)

注:與空白對(duì)照組比較:▲ P<0.05，▲▲ P<0.01;與模型組比較:*P<0.05，**P<0.01

OD±SD ALT±SD OD±SD AST±SD空白對(duì)照組 0.089±0.014 30.47±9.04 0.084±0.018 52.00±1組 別3.92模 型 組 0.270±0.029 151.07±19.49▲ 0.264±0.052 191.08±40.32▲▲聯(lián) 苯 雙 酯 0.266±0.034 98.27±22.37** 0.265±0.029 91.23±22.46辛伐他汀 0.274±0.026 153.73±17.57 0.266±0.048 196.38±37.12血 脂 康 組 0.271±0.018 145.27±11.92 0.229±0.022 173.54±16.70 Z 1高 劑 量 0.206±0.027 108.07±17.90** 0.209±0.029 128.61±22.25**Z 1低 劑 量 0.235±0.056 124.11±35.63* 0.211±0.040 130.23±31.68*D 1高 劑 量 0.203±0.024 105.87±16.16** 0.170±0.045 118.54±34.70**D 1低 劑 量 0.227±0.041 122.20±27.25* 0.224±0.027 129.84±27.41*

4 討論

大量的研究表明，在肝細(xì)胞的病變過(guò)程中，自由基、酶以及脂質(zhì)過(guò)氧化物等均發(fā)揮重要的作用。四氯化碳致小鼠肝損傷的機(jī)制為:四氯化碳在肝內(nèi)經(jīng)微粒體細(xì)胞色素分解活化，形成三氯甲基自由基和氯自由基，這些自由基與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，可攻擊肝細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使膜通透性升高，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，存在于肝細(xì)胞質(zhì)中的可溶性酶ALT和AST釋放入血 ，因此血清中 ALT、AST水平高低可以反映肝細(xì)胞損傷程度，并可作為評(píng)價(jià)藥物保肝作用的指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型與空白組相比，ALT、AST的濃度均有極顯著性升高(P<0.01)，表明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功。竹節(jié)參多糖、總皂苷的高劑量組與模型組相比，對(duì) ALT、AST升高均有極其顯著性的降低作用(P<0.01);竹節(jié)參多糖、總皂苷的低劑量組與模型組相比，對(duì) ALT、AST升高有顯著性的降低作用(P<0.05)。因此實(shí)驗(yàn)顯示，竹節(jié)參多糖、總皂苷具有良好的保肝降酶作用。我們還首次發(fā)現(xiàn)了竹節(jié)參多糖、總皂苷的保肝降酶活性作用，具有創(chuàng)新性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，降脂西藥辛伐他汀和中藥血脂康均不具有保肝降酶作用。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究證明，竹節(jié)參多糖、總皂苷具有顯著性降脂作用，且其降脂作用與藥辛伐他汀相當(dāng)。本實(shí)驗(yàn)還證明竹節(jié)參多糖、總皂苷具有確切的保肝降酶作用，并從另一個(gè)側(cè)面證明其具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為降脂藥物的優(yōu)勢(shì)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].1部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.129.

[2]徐淑云.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版社.1993.

[3]錢麗娜，陳平，陳新，等.鄂產(chǎn)人工栽培竹節(jié)參總皂苷成分的活性研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)第九屆中藥鑒定學(xué)術(shù)會(huì)議論文集.343-344.

[4]錢麗娜，陳平，李小莉，等.鄂產(chǎn)竹節(jié)參總皂苷成分抗氧化活性研究[J].武漢植物學(xué)研究，2008，26(6):674-676.

[5]許彬，陳平，陳新.酶法提取竹節(jié)參中多糖成分的工藝研究[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33(13):1549-1551.

[6]許彬，陳平.竹節(jié)參粗多糖的初步純化工藝研究[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，27(4):5-8.