李云鵬, 周寶利, 李之璞, 尹玉玲

(1.黑龍江大學農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學院,哈爾濱 150080; 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院,沈陽 110161;3.沈陽市農(nóng)業(yè)科學院,沈陽 110034)

隨著蔬菜專業(yè)化生產(chǎn)和設(shè)施栽培的發(fā)展,茄子連作栽培越來越普遍,致使茄子黃萎病逐年加重,一般發(fā)病后產(chǎn)量損失20%～30%,嚴重時損失達60%以上,有的地塊近于絕收[1]。目前,生產(chǎn)上利用野生抗病茄作為砧木進行嫁接,起到了較好的防治效果,同時砧木野生茄的抗病性也得到了驗證[2-3]。但嫁接技術(shù)耗費人力財力,且對技術(shù)、環(huán)境、植株都有嚴格的要求,在一定程度上限制了其應(yīng)用。近年來化感作用成為人們研究的熱點,植物主要通過其地上部的揮發(fā)、雨水淋洗、根系分泌、植株殘體的腐解以及花粉直感等途徑向環(huán)境中釋放化感物質(zhì),從而對周圍生物產(chǎn)生直接或間接的、有害或有利的影響[4]。利用化感作用原理,從植物中提取、分離有生物活性的化感物質(zhì)或合成相應(yīng)的化合物前體,它們可以是土壤微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、有害化感物質(zhì)的降解劑或土壤消毒劑,可以起到控制作物病害的作用;通過向土壤中施入以植物殘體為主的添加物,使其在土壤中揮發(fā)、分解或被土壤水溶析出化感物質(zhì)可抑制病原微生物,實現(xiàn)防病功效。目前,國內(nèi)外學者將此法作為作物病害生物防治的一種環(huán)境友好方法,進行了許多有益研究[5-12]。本課題組前期研究表明,野生抗病茄托魯巴姆(Solanum torvum)葉片腐解物[13]和浸提物[14],對茄子黃萎病菌具有較強的抑制作用,防病效果明顯。本文在此基礎(chǔ)上,初步研究了托魯巴姆葉片土壤添加物和浸提物控制茄子黃萎病抗性的生理機制,以期為充分利用野生茄子資源抗黃萎病等土傳病害,克服連作障礙,提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生茄葉片材料：種植野生茄托魯巴姆(Solanum torvum),當試材接近成熟期時采集葉片,清洗干凈,于干燥箱內(nèi)60℃烘干,粉碎過40目篩(孔徑0.37 mm)備用。

盆栽試驗所用試材：感病品種‘西安綠茄'(Solanum melongena L.)。

供試菌種：茄子黃萎病菌(Verticillium dahliae),于茄子連作病圃中發(fā)病植株上分離得到,按照柯赫氏法則鑒定后用于試驗。

藥劑：50%五氯硝基苯可濕性粉劑,防治對象為茄子黃萎病、褐紋病等。

1.2 盆栽防病試驗

土壤添加物防病試驗：取粉碎葉片24 g,與2 kg茄子連作土(其中加入了占總量1/4的腐熟過篩馬糞)混合均勻,裝入花盆,澆 500 mL清水,用塑料布覆蓋嚴密,日曬14 d后揭去塑料布再晾曬7 d,得到含有葉片腐解物的土壤混合物,然后定植茄子植株。以先接種病原菌再定植茄株的為治療處理,以定植5 d后再接種病原菌的為預(yù)防處理。同時設(shè)藥劑處理(每盆以1.5 g/L的50%五氯硝基苯可濕性粉劑0.5 L灌根)和不加任何添加物的對照(CK)。

浸提物防病試驗：稱取粉碎后的葉片材料,按1∶5(W/V)加入 80%乙醇,超聲波振蕩 60 min,3 500 r/min離心20 min,取上清液于MAXI dry lyo型凍干機上冷凍濃縮至干,再以50%乙醇定容至1 g/mL,為浸提物母液,于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。預(yù)防處理為定植后以浸提物母液的100倍稀釋液0.5 L灌根,5 d后將植株取出接種茄子黃萎病菌,治療處理為先接種病原菌懸浮液,然后以浸提液灌根,浸提液的用量同預(yù)防處理。同時設(shè)藥劑處理(每盆以1.5 g/L的50%五氯硝基苯可濕性粉劑0.5 L灌根)和清水灌根的對照(CK)。

土壤添加物和浸提物試驗均為每處理6盆,每盆定植1株。采取蘸根法接種,黃萎病菌孢子懸浮液濃度為1×107cfu/mL。按照黃萎病的分級標準[15],于對照嚴重發(fā)病時調(diào)查發(fā)病情況,計算病情指數(shù)和防效。

1.3 盆栽生長狀況及抗性相關(guān)生理指標測定

以近10年未種植過茄科植物的非連作土壤(其中加入了占總量1/4的腐熟過篩馬糞)為基質(zhì)(前茬為甜瓜),于茄子幼苗3片真葉展開時進行溫室盆栽定植。土壤添加物的處理方法、浸提物的施用方法均同防病試驗(1.2),不同之處是浸提物處理定植時灌根1次,之后每5 d灌根1次,共處理5次。各處理均設(shè)接菌和不接菌2種處理方式,接菌處理為定植5 d后再接菌,即采取預(yù)防處理方法接菌。設(shè)清水灌根為對照(CK)。每個處理種植8盆,3次重復,田間隨機區(qū)組排列。

取樣方法：于浸提液最后一次處理后的第10天取樣測定。未接菌區(qū)選取生長一致的健壯植株取樣,接菌區(qū)選取發(fā)病相對一致能代表本區(qū)普遍水平的植株取樣,每小區(qū)取樣3株,取樣時盡量不傷害根系。

生長指標的測定：分別測定植株的株高、莖粗、根長、葉面積(用便攜式葉面積儀MODEL L1-3000測定)、地上部分干重和根干重。

植株生理指標的測定：根系活力、細胞膜透性、丙二醛(MDA)含量、脯氨酸含量和可溶性糖含量分別采用T TC法、外滲電導法、硫代巴比妥酸(TBA)比色法、茚三酮顯色法和蒽酮法測定[16]。小區(qū)內(nèi)3株植株混合取樣,每個小區(qū)樣品作為1次重復,共3次重復。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理,用DPS統(tǒng)計軟件以 Duncan新復極差法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤添加物和浸提物的防病效果

土壤添加物治療和預(yù)防處理的病情指數(shù)均與藥劑處理無顯著差異,但顯著低于對照(見表1);浸提物治療和預(yù)防處理的病情指數(shù)均極顯著低于對照和藥劑(見表2)。其中,土壤添加物預(yù)防處理的防治效果為50.00%,浸提物治療和預(yù)防處理的防治效果分別為66.15%和65.68%,均達50.00%以上。

表1 土壤添加物的防病效果1)

表2 浸提物的防病效果1)

2.2 土壤添加物和浸提物對茄子植株生長的影響

野生茄葉片土壤添加物和浸提物對茄子植株生長狀況具有一定的影響,多數(shù)指標優(yōu)于對照。從各處理的未接菌植株與接菌植株方差分析結(jié)果可見,接菌(感病)后多數(shù)生長指標顯著降低。土壤添加物處理的未接菌植株,除根冠比與對照差異不顯著外,其他各生長指標均顯著高于對照,土壤添加物處理的接菌植株,株高、根長、地上部分干重和葉面積均顯著高于對照,根干重和根冠比與對照差異不顯著,而莖粗顯著低于對照。浸提物處理的未接菌植株,除株高顯著高于對照外,其他各生長指標均與對照差異不顯著,浸提物處理的接菌植株,株高和葉面積顯著高于對照,莖粗顯著低于對照,其他各生長指標均與對照無顯著差異。總體看,經(jīng)土壤添加物處理的植株,生長狀況明顯優(yōu)于相應(yīng)對照,經(jīng)浸提物處理的植株,多數(shù)生長指標也略高于對照;但土壤添加物和浸提物的接菌植株莖粗均較對照降低(表3)。

表3 各處理對茄子植株生長狀況的影響1)

2.3 土壤添加物和浸提物對茄子植株抗性相關(guān)生理指標的影響

2.3.1 土壤添加物和浸提物對茄子根系活力的影響

土壤添加物和浸提物處理均能提高未接菌和接菌植株的根系活力。土壤添加物和浸提物處理的未接菌植株根系活力分別較對照提高96.18%和73.77%,接菌植株分別較對照提高 149.83%和127.29%。方差分析表明,土壤添加物和浸提物處理的未接菌和接菌植株根系活力均顯著高于相應(yīng)的對照。各處理未接菌植株的根系活力均顯著高于接菌植株?？梢?接菌(感病)后植株根系活力顯著下降,但土壤添加物和浸提物處理能夠緩解根系活力下降的幅度(圖1)。

2.3.2 土壤添加物和浸提物對茄子葉片細胞膜透性的影響

植物組織在受到逆境傷害時,膜結(jié)構(gòu)會遭破壞,使膜透性大大增加,細胞內(nèi)的物質(zhì)(尤其是電解質(zhì))大量外滲,從而引起組織浸泡液的電導率增大。本試驗表明(圖2),各處理的未接菌植株葉片電導率均低于接菌植株,但只有對照差異顯著。土壤添加物和浸提物處理對植株葉片電導率均有降低的作用,未接菌植株分別較對照降低6.67%和17.10%,但均與對照差異不顯著,接菌植株分別較對照降低16.89%和42.25%,其中浸提物處理的接菌植株顯著低于對照?？梢?在接菌(感病)情況下,土壤添加物和浸提物處理可減輕病原菌侵染造成的逆境對膜質(zhì)的傷害程度。

2.3.3 土壤添加物和浸提物對茄子植株丙二醛含量的影響

植物在逆境條件下,往往發(fā)生膜脂過氧化作用,其產(chǎn)物丙二醛(MDA)會嚴重損傷生物膜,通常利用它作為脂質(zhì)過氧化的指標。本試驗表明(圖3),土壤添加物處理的未接菌植株葉片MDA含量與接菌植株差異不顯著,而浸提物處理及對照的接菌植株葉片MDA含量均顯著高于未接菌植株。土壤添加物和浸提物處理的未接菌植株葉片MDA含量與對照差異不顯著,而接菌植株顯著低于對照。

土壤添加物處理的未接菌植株根系的MDA含量與接菌植株相差不大,浸提物處理和對照的接菌植株MDA含量顯著高于未接菌植株。土壤添加物和浸提物處理的未接菌植株根系的MDA含量均與對照差異不顯著;土壤添加物處理的接菌植株根系MDA含量顯著低于對照,而浸提物處理與對照差異不顯著。

可見,土壤添加物和浸提物處理具有降低接菌(感病)植株葉片及根系MDA含量的作用。

圖3 各處理對茄子葉片和根系MDA含量的影響

2.3.4 土壤添加物和浸提物對茄子植株脯氨酸含量的影響

各處理接菌植株葉片和根系脯氨酸含量均顯著高于未接菌植株,土壤添加物、浸提物和對照的接菌植株較未接菌植株葉片脯氨酸含量分別增加60.24%、109.44%和 228.61%,根系分別增加39.51%、62.76%和633.63%。土壤添加物和浸提物處理的未接菌植株葉片和根系脯氨酸含量均與對照相差不大,而接菌植株均顯著低于對照(圖4)?？梢?土壤添加物和浸提物能夠降低接菌(感病)條件下植株葉片和根系脯氨酸含量上升的幅度。

2.3.5 土壤添加物和浸提物對茄子植株可溶性糖含量的影響

土壤添加物和浸提物處理的接菌植株葉片可溶性糖含量較未接菌植株升高,而對照則降低。土壤添加物處理的未接菌植株葉片可溶性糖含量顯著低于對照,浸提物與對照差異不顯著;土壤添加物和浸提物處理的接菌植株葉片可溶性糖含量均顯著高于對照(圖5)。

圖4 各處理對茄子葉片和根系脯氨酸含量的影響

土壤添加物和浸提物處理的接菌植株根系中可溶性糖含量較未接菌植株降低,這與葉片中可溶性糖含量的變化不同。土壤添加物和浸提物處理的未接菌和接菌植株根系中可溶性糖含量均顯著高于相應(yīng)的對照。對照接菌植株根系中可溶性糖含量較未接菌植株極顯著下降,而土壤添加物和浸提物處理則能夠保持相對較高的水平(圖5)。

可見,土壤添加物和浸提物處理能夠通過提高植株葉片和根系中可溶性糖含量水平而抵御病菌侵染造成的逆境。

圖5 各處理對茄子葉片和根系中可溶性糖含量的影響

3 結(jié)論與討論

本研究表明野生茄托魯巴姆葉片土壤添加物和浸提物對茄子黃萎病的預(yù)防和治療效果顯著。土壤添加物和浸提物有促進植株生長、提高植株根系活力的作用,經(jīng)土壤添加物和浸提物處理的接菌(感病)植株葉片相對電導率增幅明顯低于對照,葉片和根系的MDA和脯氨酸含量顯著低于對照,可溶性糖含量顯著高于對照。

本課題組前期研究[17]發(fā)現(xiàn),野生茄托魯巴姆葉片土壤腐解混合物和浸提物在濃度為0.5～40 g/L范圍內(nèi),對茄子黃萎病菌菌絲生長均表現(xiàn)出隨濃度增大,化感抑制作用增強的趨勢,且濃度為 10～40 g/L范圍內(nèi),抑制率變化不大。本研究考慮到試材的用量問題,故選擇了濃度為12 g/L對應(yīng)的混合比率。

在進行盆栽試驗時,為防止土壤發(fā)生板結(jié)和增加肥力,在所用土壤中加入了占總量1/4的腐熟馬糞。因此認為,野生茄葉片土壤添加物對土壤有機質(zhì)和營養(yǎng)的影響應(yīng)該可以忽略不計,處理對植株的影響主要是化感作用的結(jié)果。為了更好地研究土壤添加物和浸提物對連作條件下茄子黃萎病的防效,防病試驗用的是茄子連作病土,土壤中存在茄子黃萎病菌且土壤微生物種群結(jié)構(gòu)處于失衡狀態(tài)[18-19]。為比較處理對接菌(感病)和不接菌(健康)植株的影響,以探討處理調(diào)控茄子黃萎病抗性的可能機制,生長狀況及抗性相關(guān)生理指標測定所用盆栽土壤為近10年未種植過茄科植物的非連作土壤,土壤中不含黃萎病菌,土壤微生物種群結(jié)構(gòu)較合理[19]。

有關(guān)土壤添加劑的相關(guān)研究均表明,良好的土壤添加劑不僅能增加土壤的養(yǎng)分含量,改善土壤理化性狀,促進植物生長發(fā)育,提高產(chǎn)量和品質(zhì),對土傳根部病害也有較好的控制作用[5-7,9-10]。植物的根系是吸收水肥的重要器官,又是物質(zhì)同化、轉(zhuǎn)化和合成的器官,因此根系的生長發(fā)育狀況直接影響植物個體的生命活動。張磊等[20]研究認為,根系活性升高能提高茄子植株抗逆性。本試驗研究了野生茄托魯巴姆葉片土壤添加物和浸提物對植株的生長狀況的影響,土壤添加物和浸提物在降低茄子黃萎病病情指數(shù)的同時,還能夠改善植株生長發(fā)育狀況(其中,植株葉面積增加最明顯),根系活力增強。

細胞膜的選擇透性是其最重要的功能之一,各種逆境傷害都會造成質(zhì)膜選擇透性的改變或喪失,其在一定程度上反映了細胞的受損程度,并與植物的抗逆性密切相關(guān)[21]。丙二醛(MDA)作為膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物,其含量是膜脂過氧化程度的一個重要標志,而膜脂過氧化的加劇引起質(zhì)膜透性增大,致使電解質(zhì)大量外滲,因此植物組織浸泡液的電導率和MDA含量常作為細胞膜傷害程度的指標。嫁接茄子苗期黃萎病抗性與相對電導率和MDA含量顯著降低有關(guān)[22]。本研究表明,土壤添加物和浸提物處理的植株葉片相對電導率增幅明顯低于對照,相對電導率值也顯著低于對照;土壤添加物和浸提物能夠降低接菌(感病)條件下葉片和根系MDA含量?？梢?土壤添加物和浸提物能夠減輕植株體因病原菌侵染而造成的膜脂過氧化作用強度,降低膜傷害程度,從而提高植株抗病性。

脯氨酸在植物體內(nèi)具有束水能力,對維持酶的正常活性及細胞膜透性、穩(wěn)定蛋白質(zhì)特性具有重要作用。本研究中,土壤添加物和浸提物處理的感病植株葉片和根系脯氨酸含量均低于對照,這與嫁接茄抗病研究中脯氨酸含量的變化一致[14]。這種變化的原因可能是土壤添加物和浸提物處理的植株抗病性提高,感病程度較低,致使以積累脯氨酸來緩解病原菌侵害的作用減弱?？扇苄蕴窃谥参矬w內(nèi)大量存在,高糖有利于茄科植物抗黃萎病[3]。在接菌逆境下,土壤添加物和浸提物處理的病株葉片和根系可溶性糖含量均顯著高于對照,且在未接菌條件下根系可溶性糖含量也明顯高于對照,這亦與嫁接茄抗病研究中可溶性糖含量的變化一致[3]?？梢?土壤添加物和浸提物可提高接菌(感病)植株可溶性糖含量,從而增強植株的抗病性。

綜上所述,認為野生茄葉片土壤添加物和浸提物能夠提高植株抗膜脂過氧化的能力,保持細胞膜的穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)植株體內(nèi)抗病相關(guān)生理活性物質(zhì)含量,從而提高茄子植株的黃萎病抗性,取得良好的防病效果。因此認為,利用野生茄葉片土壤添加物和浸提物來調(diào)控茄子土傳病害黃萎病抗性是可行的。本試驗為利用野生抗病茄托魯巴姆防治茄子黃萎病提供了理論依據(jù)。土壤添加物和浸提物對環(huán)境無毒、無污染,能夠維護健康、和諧、安全的栽培生態(tài)環(huán)境,符合可持續(xù)發(fā)展的原則,因此具有較大的應(yīng)用潛力。本文僅報道了野生茄葉片土壤添加物和浸提物對茄子植株部分抗性生理指標的影響,其他抗性調(diào)控機制尚待進一步探討。

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