譚琳鎣 趙天平 國(guó)蘭琴 趙琛 劉慧榮 朱慧華 崔云華

衰老是生物體各種功能普遍衰弱，以及抵抗環(huán)境傷害和恢復(fù)體內(nèi)平衡能力降低的過(guò)程[1]。近年來(lái)，全球老年人口比重迅速上升[2]，探索衰老機(jī)理，延緩衰老、防治與衰老相關(guān)的疾病、提高老年人的生活質(zhì)量，對(duì)全球的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和衛(wèi)生事業(yè)將帶來(lái)重大的影響。本研究采用自然衰老大鼠模型，觀察溫和灸“腎俞”穴對(duì)自然衰老大鼠肝組織原癌基因Rb(Rb)、原癌基因P53(P53)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、蛋白激酶C(PKC)表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步探討艾灸延緩衰老的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的2月齡雄性清潔級(jí)SD (Sprauge-Dawley)大鼠共24只，SPF級(jí)，體重(160±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組8只、自然衰老組8只、艾灸組8只。

1.2 主要試劑與儀器

Rb原位雜交試劑盒、P53原位雜交試劑盒、Bcl-2原位雜交試劑盒、PKC原位雜交試劑盒、羊抗兔SABC試劑盒、羊抗小鼠SABC試劑盒、兔抗大鼠Rb多克隆抗體、小鼠抗大鼠P53單克隆抗體、小鼠抗大鼠Bcl-2單克隆抗體、小鼠抗大鼠蛋白酶C單克隆抗體、DAB顯色試劑盒等選用武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；儀器包括恒溫雜交爐(OLS 200)、顯微鏡(OLYMPUS BH2)、Motic圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.3 造模方法

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，在SPF級(jí)環(huán)境設(shè)施中正常飼養(yǎng)20個(gè)月，待其自然進(jìn)入衰老期[4]。

1.4 分組與處理

正常組：正常情況下飼養(yǎng)9周。

自然衰老組：正常情況下飼養(yǎng)20個(gè)月。

艾灸組：溫和灸腎俞穴[3]，每日1次，每次5分鐘，5次為一療程，每療程結(jié)束后休息2天，再進(jìn)行下一療程，共治療20個(gè)月。

1.5 標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死各組大鼠，摘取肝臟，分別置于液氮或10%中性甲醛固定液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.6.1 原位雜交方法檢測(cè)大鼠肝組織Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA的表達(dá)

原位雜交探針由復(fù)旦科技有限公司合成。引物序列、探針長(zhǎng)度見(jiàn)表1。Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA原位雜交檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

陰性對(duì)照：以預(yù)雜交液代替雜交液，并完成整個(gè)過(guò)程。

棕黃色為陽(yáng)性信號(hào)，陰性對(duì)照無(wú)陽(yáng)性著色。每張片子隨機(jī)采集3個(gè)視野，運(yùn)用MOTIC圖象分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度進(jìn)行分析。

表1 Rb、P53、Bcl-2、PKC引物序列與探針長(zhǎng)度

1.6.2 免疫組化方法檢測(cè)大鼠肝組織Rb、P53、Bcl-2、PKC的蛋白表達(dá)

Rb、P53、Bcl-2、PKC蛋白免疫組化檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

陰性對(duì)照：以抗體稀釋液代替第一抗體孵育，并完成整個(gè)操作。

棕黃色為陽(yáng)性信號(hào)，陰性對(duì)照無(wú)陽(yáng)性著色。每張片子隨機(jī)采集3個(gè)視野，運(yùn)用MOTIC圖象分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組均值以表示，應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行單因素方差分析，不符合方差分析條件的，采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織Rb mRNA表達(dá)的影響

表2、圖1顯示，自然衰老組大鼠肝組織Rb mRNA陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著高于正常組(P<0.01)，艾灸組肝組織Rb mRNA陽(yáng)性表達(dá)面積顯著低于自然衰老組(P<0.01)，但未達(dá)到正常水平(與正常組比較P<0.05)。艾灸組肝組織Rb mRNA陽(yáng)性表達(dá)光密度也顯著降低(P<0.01)，且與正常組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.2 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織P53 mRNA表達(dá)的影響

表3、圖2顯示，自然衰老組大鼠肝組織P53 mRNA陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著高于正常組(P<0.05，P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織P53 mRNA陽(yáng)性表達(dá)面積與陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著低于自然衰老組 (P<0.05，P<0.01)，但均未達(dá)到正常水平(P<0.05，P<0.01)。

表2 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織Rb mRNA表達(dá)的影響

表3 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織P53 mRNA表達(dá)的影響

2.3 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

表4、圖3顯示，自然衰老組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著低于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA陽(yáng)性表達(dá)面積顯著高于自然衰老組(P<0.01)，但未達(dá)到正常水平(與正常組比較P<0.05)。艾灸組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA陽(yáng)性表達(dá)光密度也顯著增強(qiáng)(P<0.01)，且與正常組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表4 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

2.4 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織PKC mRNA表達(dá)的影響

表5、圖4顯示，自然衰老組大鼠肝組織PKC mRNA陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著低于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織PKC mRNA陽(yáng)性表達(dá)面積與陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著高于自然衰老組(P<0.01)，但均未達(dá)到正常水平(P<0.01，P<0.05)。

表5 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織PKC mRNA表達(dá)的影響

2.5 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織Rb蛋白表達(dá)的影響

表6、圖5顯示，自然衰老組大鼠肝組織Rb蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著高于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織Rb蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著低于自然衰老組(P<0.01)，但與正常組比較仍有顯著性差異(P<0.01)。

表6 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織Rb蛋白表達(dá)的影響

2.6 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織P53蛋白表達(dá)的影響

表7、圖6顯示，自然衰老組大鼠肝組織P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著高于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織P53蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積與陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著低于自然衰老組(P<0.01)，但與正常組比較仍有顯著性差異(P<0.01)。

表7 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織P53蛋白表達(dá)的影響

注： 與正常組比較：aP<0.01，與自然衰老組比較：bP<0.01

2.7 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表8、圖7顯示，自然衰老組大鼠肝組織Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著低于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積與陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著高于自然衰老組(P<0.01)，但均未達(dá)到正常水平(P<0.01)。

表8 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織Bcl-2

2.8 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織PKC蛋白表達(dá)的影響

表9、圖8顯示，自然衰老組大鼠肝組織PKC蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積和陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著低于正常組(P<0.01)，艾灸組大鼠肝組織PKC蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積與陽(yáng)性表達(dá)光密度均顯著高于自然衰老組(P<0.01，P<0.05)，但均未達(dá)到正常水平(P<0.05，P<0.01)。

表9 溫和灸對(duì)自然衰老大鼠肝組織PKC

圖1 各組大鼠肝組織Rb mRNA的表達(dá)

圖2 各組大鼠肝組織P53 mRNA的表達(dá)

圖3 各組大鼠肝組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)

圖4 各組大鼠肝組織PKC mRNA的表達(dá)

圖5 各組大鼠肝組織Rb蛋白的表達(dá)

圖6 各組大鼠肝組織P53蛋白的表達(dá)

圖7 各組大鼠肝組織Bcl-2蛋白的表達(dá)

圖8 各組大鼠肝組織PKC蛋白的表達(dá)

3 討論

衰老的發(fā)生由多種信號(hào)觸發(fā)所致，腫瘤抑制基因是其中之一[4-7]。研究顯示：Rb、P53、Bcl-2、PKC與衰老關(guān)系密切。Rb、P53是一類負(fù)性細(xì)胞周期的調(diào)控蛋白，為延緩衰老的負(fù)相調(diào)控因子，抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞停滯于G1期，參與細(xì)胞周期分裂、衰老與凋亡。在衰老的細(xì)胞中，Rb僅以其活性的低磷酸化的生長(zhǎng)抑制形式存在[8]。P53是序列特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，通過(guò)直接或間接的方式活化或抑制其靶基因，介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯或凋亡。P53 mRNA較高水平表達(dá)于衰老細(xì)胞[9-12]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Rb/P53細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因及蛋白在衰老大鼠睪丸組織發(fā)生明顯改變，衰老大鼠睪丸組織P53、Rb基因表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)[13]。本研究結(jié)果顯示，自然衰老大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于正常組，Rb、P53 mRNA及蛋白表達(dá)與衰老呈負(fù)相關(guān)；艾灸組(溫和灸20個(gè)月)大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于自然衰老組，提示溫和灸可抑制衰老大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及其蛋白的表達(dá)。

Bcl-2、PKC為延緩衰老的正相調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞的增殖、分化、存活與衰亡的調(diào)控。Bcl-2多位于細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生較多的位置，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等，與細(xì)胞的抗氧化自我保護(hù)關(guān)系密切。Bcl-2對(duì)各種刺激誘導(dǎo)的凋亡有阻抑效應(yīng)，又稱為長(zhǎng)壽基因，通常被作為衰老檢測(cè)的參數(shù)指標(biāo)[14]。在衰老細(xì)胞里，Bcl-2表達(dá)降低[15-17]。有實(shí)驗(yàn)表明Bcl-2的過(guò)量表達(dá)能使多種造血細(xì)胞在去除生長(zhǎng)因子后壽命延長(zhǎng)[18]。PKC廣泛分布于哺乳動(dòng)物的器官、組織和細(xì)胞中，參與多種細(xì)胞活動(dòng)調(diào)控[19]?；罨腜KC能使蛋白質(zhì)底物上的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵分子之一。在衰老細(xì)胞內(nèi)，PKC的功能失調(diào)[20,21]，在細(xì)胞衰老的發(fā)生發(fā)展中起著決定性的作用[22]。本研究中，自然衰老大鼠肝組織Bcl-2、PKC mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于正常組；艾灸組(溫和灸20個(gè)月)大鼠肝組織Bcl-2、PKC mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于自然衰老組，提示溫和灸可促進(jìn)衰老大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及其蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本文研究結(jié)果提示：自然衰老大鼠肝組織Rb、P53 mRNA及其蛋白表達(dá)升高，Bcl-2、PKC mRNA及其蛋白表達(dá)降低。溫和灸能抑制Rb、P53 mRNA及其蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2、PKC mRNA及其蛋白的表達(dá)，這可能是溫和灸延緩衰老的途徑之一。

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