李秋恬，洪 敏，陳 曉，李少遊，繆延棟，耿計偉，李 臣，尹燕鷹，董 堅

(昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

IHA-01(代號)是從云南傳統(tǒng)藥用植物水朝陽旋覆花中提取、精制的天然藥物，主要含半萜類抗腫瘤活性成份。2009年8月～2010年12月，我們對IHA-01的敏感細(xì)胞株進行了篩選，并對其誘導(dǎo)敏感細(xì)胞株凋亡的作用進行了觀察，旨在為IHA-01作為抗腫瘤藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 IHA-01(本課題組委托中科院昆明植物所提取，相對分子質(zhì)量為306)。細(xì)胞株:人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435，人腸癌細(xì)胞株 HCT-8、HT29、LS-174T，人肺癌細(xì)胞株 Calu-1，人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721，人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2，人膽管癌細(xì)胞株 QBC-939，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251(均購于上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫，本室保存);人個舊肺癌細(xì)胞株GLC、YTLC(本實驗室傳代培養(yǎng))。FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國 B-D公司)。

1.2 敏感細(xì)胞株篩選

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù) 分別選取對數(shù)生長期的上述12種腫瘤細(xì)胞接種于96孔板，貼壁培養(yǎng)24 h;均分為兩組。實驗組加入IHA-01，終濃度分別為3.125、6.25、12.5、25 和 50 μg/ml，每個濃度設(shè) 5 個復(fù)孔;對照組加入等體積不含藥物的培養(yǎng)基，96孔板置于溫箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 觀察項目及判定標(biāo)準(zhǔn) CCK-8法測定各組細(xì)胞增殖抑制率:試劑作用后采用酶標(biāo)儀測定波長450 nm、650 nm處各孔吸光度值(A值)，細(xì)胞增殖抑制率=［1－(A加藥組－A空白組)/(A陰性對照組－A空白組)］×100%。用線性回歸方法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。IC50值最低者為敏感細(xì)胞株，IC50值最高者為不敏感細(xì)胞株;細(xì)胞增殖抑制率最高的作用濃度為最佳作用濃度。

1.2.3 篩選結(jié)果 IHA-01對12株腫瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制殺傷作用，細(xì)胞增殖抑制率隨IHA-01濃度增加而升高;最佳作用濃度為1.29 μg/ml。MDA-MB-231、MDA-MB-435、HCT-8、HT29、LS-174T、GLC、YTLC、Calu-1、SMMC-7721、CNE-2、QBC-939 和 U251的 IC50值分別為(4.81 ±1.13)、(5.07±2.73)、(1.29 ± 0.35)、(4.77 ± 0.37)、(5.12 ±1.26)、(6.09 ± 1.68)、(7.23 ± 2.57)、(5.33 ±0.82)、(7.67 ± 1.66)、(7.94 ± 1.84)、(6.09 ±1.44)和(7.4 ±0.73)μg/ml，最低及最高 IC50值分別為HCT-8及CNE-2細(xì)胞。確定HCT-8為IHA-01敏感株，CNE-2為不敏感株。

1.3 IHA-01干預(yù)敏感細(xì)胞株及相關(guān)指標(biāo)檢測

1.3.1 IHA-01干預(yù)及細(xì)胞形態(tài)觀察 取1.29 μg/ml的IHA-01分別作用于HCT-8細(xì)胞及CNE-2細(xì)胞，48 h后光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2 IHA-01干預(yù)及細(xì)胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期HCT-8細(xì)胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中并分為兩組。實驗組加入 IHA-01，使其終濃度為 1.29 μg/ml;對照組加入同體積PBS。藥物作用24 h后收集細(xì)胞1×106個，PBS重懸于EP管中，緩慢加入70%的冰乙醇1 ml，4℃固定1 h，采用Annexin V/7-AAD染色，結(jié)果以Annexin V標(biāo)記陽性，7-AAD標(biāo)記陰性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3 IHA-01干預(yù)及細(xì)胞端粒酶活性檢測 取1.29、6.25、12.5、25 和 50 μg/ml濃度的 IHA-01 分別作用于HCT-8細(xì)胞(實驗組)，24 h后收集2×105個細(xì)胞采用PCR-ELISA法行端粒酶活性檢測，按試劑盒說明書操作。對照組為未加入藥物HCT-8細(xì)胞。實驗重復(fù)3次，酶標(biāo)儀測定450～690 nm處的光密度值(A值)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS12.0軟件包行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析和t檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài) IHA-01作用后HCT-8細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)由不規(guī)則形變?yōu)閳A形，胞體皺縮，貼壁能力降低，細(xì)胞質(zhì)密度增加，細(xì)胞膜完整;CNE-2細(xì)胞僅有部分失去原有形態(tài)、胞體皺縮。

2.2 細(xì)胞凋亡率 1.29 μg/ml IHA-01作用24 h后，實驗組及對照組 HCT-8細(xì)胞凋亡率分別為62.3%、11.3%，P ＜0.01。

2.3 細(xì)胞端粒酶活性 兩組端粒酶活性比較見表1。由表1可見，不同濃度IHA-01均可抑制端粒酶活性，且呈濃度依賴性。

表1 不同濃度IHA-01作用24 h HCT-8細(xì)胞端粒酶活性(n=3，±s)

表1 不同濃度IHA-01作用24 h HCT-8細(xì)胞端粒酶活性(n=3，±s)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與實驗組其他濃度比較，△P均＜0.01

組別 A值1.68 ±0.012實驗組1.29 μg/ml 1.07 ±0.037＊△6.25 μg/ml 0.59 ±0.003*12.5 μg/ml 0.30 ±0.038*25 μg/ml 0.29 ±0.01*50 μg/ml 0.27 ±0.021*對照組

3 討論

從天然植物中開發(fā)生物活性成分，尋找高效低毒的抗癌新藥一直是研究的熱點。天然植物產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)獨特，生物活性廣泛，不易耐藥等優(yōu)點［1］，是抗癌活性成分的重要來源。目前臨床上常用的抗癌藥物，如抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的喜樹堿、以抗微管蛋白活性為靶點的紫杉醇和長春新堿等均為從植物中分離篩選、結(jié)構(gòu)改造及化學(xué)合成的。IHA-01是從天然植物水朝陽旋覆花中提取、精制而成。水朝陽旋覆花為菊科植物旋覆花屬，為多年生草本植物，載于《滇南本草》［2］，主治乳巖、乳癰、紅腫疼痛、暴赤火眼、目疾疼痛、祛風(fēng)明目、隱澀羞明伯日，傷風(fēng)寒熱咳嗽。

近年來越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞程序性死亡有關(guān)，部分源自天然植物的化療藥和細(xì)胞毒制劑是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而起治療作用的［3～5］;化療藥物抗腫瘤治療的部分機制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)［6］。本研究結(jié)果顯示，IHA-01對12種腫瘤細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡的作用，尤其是對HCT-8細(xì)胞。關(guān)于藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制，有學(xué)者認(rèn)為與Caspase-9、Caspase-3蛋白酶激活及Survivin蛋白表達下降有關(guān)［7］，也有學(xué)者認(rèn)為與抑制NF-κB的活性有關(guān)［8］。本研究未作上述相關(guān)指標(biāo)檢測，有待下一步研究。

端粒酶是一種維持染色體結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的核糖核蛋白，其激活與癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲及腫瘤惡性程度關(guān)系密切［9］。研究表明紫杉醇和拓?fù)涮婵档戎参镱惪鼓[瘤藥物的抗瘤作用與影響端粒酶活性有關(guān)［10，11］，故抑制端粒酶活性可能成為腫瘤治療的新策略［12～14］。有文獻報道端粒酶與細(xì)胞凋亡有一定的相關(guān)性，端粒酶活性高者細(xì)胞凋亡少，反之則凋亡增加［15］。研究證實，植物來源的化療藥物喜樹堿在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的同時，端粒酶活性亦相應(yīng)下降［16］。本研究結(jié)果顯示，IHA-01可明顯降低HCT-8細(xì)胞的端粒酶活性，且與藥物濃度呈正相關(guān)。

綜上所述，HCT-8細(xì)胞為IHA-01的敏感細(xì)胞株。IHA-01可明顯抑制HCT-8增殖，其機制可能為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、降低腫瘤細(xì)胞端粒酶活性。本研究為IHA-01的臨床應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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