顧福萍，何煥鐘，顧棟樺，徐伯贏，沈 洪

(1浙江湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江湖州313000;2湖州市中心醫(yī)院)

腎缺血再灌注是臨床中常見(jiàn)的致?lián)p傷過(guò)程，存在于失血、脫水、感染等原因所致休克、血管梗阻、腎移植等過(guò)程中，可導(dǎo)致急性腎損傷。NF－κB作為一種廣泛存在的誘導(dǎo)性核轉(zhuǎn)錄因子，其在缺血再灌注損傷中的作用是近年來(lái)缺血再灌注損傷機(jī)制研究的重要進(jìn)展［1］?；罨?NF－κB可啟動(dòng)和調(diào)節(jié)眾多與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞因子及粘附分子等炎性介質(zhì)的基因表達(dá);而抑制NF－κB的表達(dá)，則可降低炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，對(duì)再灌注損傷的組織產(chǎn)生保護(hù)作用［2］。七氟醚是一種吸入麻醉藥，已證實(shí)其對(duì)缺血再灌注心、腦、腎均有較好的保護(hù)作用［3～5］。2010年6月，我們觀察了七氟醚預(yù)處理對(duì)腎缺血再灌注大鼠腎組織NF－κB表達(dá)和一氧化氮合酶(NOS)活性的影響，旨在探討七氟醚對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年健康SD雄性大鼠72只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院;肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、NOS試劑盒均購(gòu)自江蘇南京建成生物工程研究所;NF－κB p65抗體購(gòu)自武漢博士德有限公司。

1.2 模型建立及干預(yù) 將72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(對(duì)照組)、模型組和七氟醚組各24只。后兩組參考 Basile 等［6］方法制作腎缺血再灌注損傷模型。七氟醚組制模前1 h吸入七氟醚:大鼠置于自制的有機(jī)玻璃麻醉箱內(nèi)，通過(guò)麻醉氣體揮發(fā)罐輸入O2和七氟醚的混合氣體，用麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀持續(xù)測(cè)定藥物濃度，使實(shí)驗(yàn)艙七氟醚濃度維持在2.2%。

1.3 觀察項(xiàng)目 制模后4、12、24 h各組分別處死大鼠8只，行以下項(xiàng)目觀察。①血清BUN和Cr水平:眼眶取血，采用生化分析儀常規(guī)方法測(cè)定。②腎組織病理學(xué)變化:取左腎縱切用10%中性甲醛固定，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋后切片行蘇木精—伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡觀察。③腎組織NF－κB表達(dá):取上述石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫臘，梯度乙醇入水后，免疫組化法檢測(cè)。NF－κB陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞核。于10×40倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，用圖像采集系統(tǒng)將圖像輸入計(jì)算機(jī)并進(jìn)行人工分析，取平均值。④腎組織NOS活性:取右腎組織于冰生理鹽水中漂洗、濾紙拭干、稱重后用0.86%冷生理鹽水制備10%組織勻漿，根據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)總NOS(TNOS)及誘生型NOS(iNOS)、原生型NOS(cNOS)活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清BUN及Cr水平 各組血清BUN及Cr水平見(jiàn)表1。

2.2 腎組織病理學(xué)變化 對(duì)照組腎單位結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常;模型組早期腎小球及腎間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生水腫，部分腎小管管腔變窄，少數(shù)管腔可見(jiàn)管型，間質(zhì)有極少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，損傷加重，24 h時(shí)低倍鏡下可見(jiàn)皮質(zhì)區(qū)變性廣泛，腎小管管腔可見(jiàn)管型，高倍鏡下見(jiàn)部分腎小球出現(xiàn)變性壞死，腎小管變性壞死廣泛，出現(xiàn)核固縮、溶解、消失，腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，變性壞死區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。七氟醚組病理變化較模型組明顯減輕，腎臟外觀與對(duì)照組接近，光鏡下可見(jiàn)腎小球擴(kuò)張充血、局部腎間質(zhì)充血，但較模型組明顯減輕，無(wú)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，局部腎小管未出現(xiàn)管型、輕度水樣變性。

表1 各組血清BUN及Cr水平比較(n=8，±s)

表1 各組血清BUN及Cr水平比較(n=8，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與模型組同時(shí)相比較，#P ＜0.05

檢測(cè)指標(biāo) 模型組 七氟醚組 對(duì)照組BUN(nmol/L)4 h 14.69 ± 0.99* 14.20 ±1.16* 6.73 ±1.06 12 h 34.45 ± 6.22* 15.63 ±2.90*# 6.58 ±1.49 24 h 45.41 ±11.03* 12.91 ±2.97*# 7.31 ±1.94 Cr(μmol/L)4 h 105.57 ± 6.37* 101.84 ±10.06*#73.41 ±7.64 12 h 191.34 ±56.81* 99.36 ±13.95*#75.54 ±7.51 24 h 209.63 ±54.27* 98.11 ±13.42*#73.90 ±8.89

2.3 腎組織NF－κB表達(dá) NF－κB表達(dá)均定位于腎小管上皮細(xì)胞，腎小球中未見(jiàn)表達(dá)。對(duì)照組NF－κB幾乎不表達(dá);各組NF－κB表達(dá)情況見(jiàn)表2。

表2 各組腎組織NF-κB表達(dá)比較(n=8，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，±s)

表2 各組腎組織NF-κB表達(dá)比較(n=8，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與模型組同時(shí)間比較，#P ＜0.05

4 h 12 h 24 h模型組 79.65 ±17.17* 97.62 ±21.21* 108.81 ±15.22組別*七氟醚組 26.09 ± 6.87*# 20.62 ± 7.74*# 28.58 ± 7.43*#對(duì)照組1.85 ± 1.12 1.69 ± 1.09 1.74 ± 1.23

2.4 腎組織NOS活性 各組腎組織NOS活性比較見(jiàn)表3。

表3 各組腎組織NOS活性比較(n=24，U/mg prot，±s)

表3 各組腎組織NOS活性比較(n=24，U/mg prot，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與模型組同時(shí)相比較，#P ＜0.05

組別TNOS iNOS cNOS模型組4 h 0.658 ±0.096 0.250 ±0.010* 0.407 ±0.059 12 h 0.818 ±0.245* 0.276 ±0.009* 0.542 ±0.103 24 h 0.924 ±0.303* 0.352 ±0.039* 0.572 ±0.221七氟醚組4 h 0.564 ±0.072 0.162 ±0.010*# 0.402 ±0.049 12 h 0.596 ±0.101# 0.185 ±0.009*# 0.416 ±0.089 24 h 0.630 ±0.128# 0.223 ±0.010*# 0.413 ±0.079對(duì)照組4 h 0.528 ±0.020 0.097 ±0.026 0.397 ±0.146 12 h 0.534 ±0.013 0.113 ±0.012 0.431 ±0.074 24 h 0.530 ±0.041 0.104 ±0.035 0.419 ±0.086

3 討論

NF－κB是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下NF－κB 與 κB 抑制蛋白(I－κB)結(jié)合成無(wú)活形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)其受氧自由基、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子等的刺激后被激活導(dǎo)致NF－κB快速?gòu)陌|(zhì)移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合在被誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子上特異的κB位點(diǎn)，調(diào)控相應(yīng)的靶基因表達(dá)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，NF－κB信號(hào)系統(tǒng)參與了缺血再灌注損傷過(guò)程;抑制NF－κB活性可降低炎性介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，減輕中性粒細(xì)胞的聚集，從而對(duì)再灌注損傷的組織產(chǎn)生保護(hù)作用［2］。七氟醚是一種揮發(fā)性麻醉藥，研究發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)抑制心肌細(xì)胞NF－κB活化、減少TNF－α產(chǎn)生減輕大鼠離體心肌缺血再灌注損傷［7］。Thomas等［8］發(fā)現(xiàn)，異氟醚、七氟醚、地氟醚等吸入麻醉藥可減輕腎臟缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制與抑制炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF－κB的結(jié)合活性有關(guān)。Lee等［9］在大鼠腎臟缺血再灌注模型研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚預(yù)處理能保護(hù)腎小球?yàn)V過(guò)功能。

腎缺血再灌注損傷的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞凋亡，以及血管內(nèi)皮損傷等多種病理生理過(guò)程，其中有眾多炎性介質(zhì)和免疫因子的參與［10，11］。腎臟缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生大量過(guò)氧化物和超氧自由基，激活NF－κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細(xì)胞因子、黏附分子以及炎癥反應(yīng)酶類(如iNOS)等物質(zhì)過(guò)度表達(dá)，參與腎缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展。NOS是催化合成內(nèi)源性一氧化氮的酶，目前已知NOS有兩類同工酶:原生型(constitutive NOS，cNOS)和誘生型(inducible NOS，iNOS)。NO在腎臟中的作用有直接和間接兩種，直接作用即對(duì)腎臟的保護(hù)作用，間接作用即NO的毒性作用，前者由 cNOS介導(dǎo)，而后者由 iNOS介導(dǎo)［12］。有研究顯示［13］，再灌注后腎實(shí)質(zhì)中兩種NOS mRNA表達(dá)均較缺血時(shí)顯著上調(diào)，且以iNOS最為明顯。iNOS的過(guò)表達(dá)會(huì)催化產(chǎn)生高濃度NO，直接造成細(xì)胞損傷，使腎功能進(jìn)一步受損。本研究結(jié)果顯示模型組腎組織NF－κB表達(dá)明顯增加，隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)行性增加，iNOS活性也顯著增強(qiáng)。腎功能指標(biāo)BUN、Cr呈進(jìn)行性升高，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的病理變化，腎小球毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血，腎間質(zhì)充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管管腔可見(jiàn)管型，腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，出現(xiàn)核固縮、溶解、消失，以24 h受損最為嚴(yán)重。七氟醚預(yù)處理組NF－κB的表達(dá)、iNOS的活性顯著低于模型組;BUN、Cr均明顯低于同時(shí)相的模型組;光鏡下觀察腎組織結(jié)構(gòu)受損程度較模型組明顯減輕。證實(shí)七氟醚預(yù)處理可減弱NF－κB活化、降低炎性介質(zhì)表達(dá)，減輕腎缺血再灌注損傷。

本研究結(jié)果提示NF－κB是腎缺血再灌注損傷的重要調(diào)控因子，抑制NF－κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是七氟醚預(yù)處理減輕腎缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

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