康海燕，王建彬*，董江龍，趙子龍，張紅霞，王 艷

(1石家莊市第五醫(yī)院，石家莊050021;2河北醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院)

目前研究認(rèn)為，乙肝的主要發(fā)病機(jī)制與機(jī)體感染乙肝病毒(HBV)后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)有關(guān)。HBV感染后發(fā)生的免疫耐受和慢性乙肝(CHB)與機(jī)體抗原提呈細(xì)胞［即樹突狀細(xì)胞(DC)］功能缺陷密切相關(guān)。DC是迄今體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞［1，2］，在免疫應(yīng)答誘導(dǎo)中有獨(dú)特的地位，對清除HBV起重要作用。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)是新型的免疫活性細(xì)胞，具有T細(xì)胞的抗腫瘤活性和非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性殺瘤的優(yōu)點(diǎn);CD3+CD56+T細(xì)胞是CIK群體中的主要效應(yīng)細(xì)胞。研究表明，將HBsAg致敏的DC、CIK共同培養(yǎng)，可誘導(dǎo)出HBsAg特異性CIK，增強(qiáng)各自的作用。為探討自體DC、CIK聯(lián)合干擾素治療CHB的臨床療效，我們進(jìn)行了相關(guān)臨床觀察?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇2008年5月～2010年12月在石家莊市第五醫(yī)院門診或住院治療的CHB患者320例，男180例、女140例，年齡18～63(37．8±16．3)歲，病程5～20年;均符合2005年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、感染病學(xué)分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］，ALT、AST 均 ＞80 IU/ml，HBV-DNA 定量 ＞1．0 ×106IU/ml，無其他感染及嚴(yán)重并發(fā)癥。將患者隨機(jī)分為觀察組、對照組各160例，兩組臨床資料有可比性。

1．2 方法

1．2．1 自體DC、CIK制備 抽取受試者外周靜脈血10 ml，肝素抗凝后，用生理鹽水與靜脈血以1∶1比例稀釋后，沿離心管壁緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液中，2 000 r/min離心20 min;取白膜層細(xì)胞，用生理鹽水洗滌2次，以無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞終濃度為2×106/ml，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育3 h，分離黏附細(xì)胞及非黏附細(xì)胞。黏附細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1 000 kU/L、重組人白介素4(rhIL-4)500 kU/L，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天半量換液并添加rhIL-4及rhGM-CSF;第6天加入含前S1的表面抗原20 mg/L、腫瘤壞死因子(TNF)500 μg/L，培養(yǎng)第7天收集活化 DC，對患者行皮下注射。非黏附細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基懸浮，加入干擾素10 kU/L、IL-2 500 kU/L、CD3單克隆抗體500 μg/L、IL-1 100 kU/L，隔天換液，培養(yǎng)第 7 天加入活化DC，繼續(xù)培養(yǎng)7 d后收集細(xì)胞(即HBsAg特異性CIK)，對患者行靜脈回輸。

1．2．2 治療方法 兩組均行自體DC、CIK回輸治療，第1天抽血，第7天皮下注射自體DC、第14天靜脈回輸CIK，并同時(shí)行第2次抽血，連續(xù)循環(huán)三次為一療程(抽血3次，注射DC 3次，回輸CIK 3次)。在此基礎(chǔ)上，觀察組加用干擾素500萬U，隔日1次皮下注射，連續(xù)6個(gè)月為一療程。

1．2．3 觀察指標(biāo) 兩組治療前后均檢測肝功能(包括 AST、ALT、TBIL)、HBeAg 定量及 HBV-DNA定量。

1．2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，組間比較用方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組治療前后肝功能指標(biāo)變化 見表1。治療后，對照組 AST、ALT、TBIL 分別降低(32．69 ±5．78)U/L、(30．29 ± 4．58)U/L、(7．41 ± 1．21)μmol/L，觀察組分別降低(57．01 ± 8．23)U/L、(42．66 ±6．32)U/L、(9．02 ±0．88)μmol/L;兩組比較 P 均 ＜0．05。

表1 兩組治療前后肝功能指標(biāo)變化(±s)

表1 兩組治療前后肝功能指標(biāo)變化(±s)

注:與同組治療前比較，*P＜0．01;與對照組治療后比較，#P＜0．05

組別 n ALT(U/L) AST(U/L) TBIL(μmol/L)對照組160治療前 127．37 ±19．69 101．22 ±17．22 28．28 ±4．86治療后 68．62 ±12．11* 62．02 ±13．25* 22．07 ±4．03*觀察組 160治療前 125．36 ±23．86 112．05 ±19．67 27．53 ±5．09治療后 57．21 ±11．26*#60．35 ±13．57*#18．37 ±3．94*#

2．2 兩組治療前后HBV-DNA及HBeAg定量變化見表2。

表2 兩組治療前后HBV-DNA及HBeAg定量變化(±s)

表2 兩組治療前后HBV-DNA及HBeAg定量變化(±s)

注:與同組治療前比較，*P＜0．01;與對照組治療后比較，#P＜0．05

組別 nHBV-DNA定量(IU/ml)HBeAg定量(S/CO)對照組160治療前 (5．86 ±0．98)×107 422．86 ±45．23治療后 (4．65 ±1．23)×105* 260．51 ±35．28*觀察組 160治療前 (7．51 ±2．01)×107 436．27 ±51．23治療后 (5．67 ±1．51)×104*# 200．17 ±32．11*#

3 討論

研究表明，CHB的發(fā)生、發(fā)展與HBV持續(xù)感染和機(jī)體免疫功能障礙有關(guān)［4］。DC是機(jī)體中功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在誘導(dǎo)T細(xì)胞抗病毒和抗腫瘤免疫中起核心作用［5］。細(xì)胞免疫功能低下、CD4+T細(xì)胞功能不足，是導(dǎo)致乙肝慢性化的主要原因。另外，DC也會受到 HBV感染。Beckebaum等［6］研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者單核細(xì)胞來源的DC受到HBV感染后，表現(xiàn)為抗原提呈功能下降，輔助T細(xì)胞反應(yīng)受損。提示HBV感染可抑制DC功能，減弱DC抗原提呈功能及其分泌細(xì)胞因子的能力，使HBV感染持續(xù)。CHB患者皮下注射自身活化的DC，可明顯提高其對機(jī)體淋巴細(xì)胞的活化能力，誘導(dǎo)針對HBV特異性細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

CIK是新型的免疫活性細(xì)胞，它是由IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的殺傷細(xì)胞，具有T細(xì)胞的抗瘤活性和MHC限制性殺瘤的優(yōu)點(diǎn)。將HBsAg致敏的DC與CIK共同培養(yǎng)，可誘導(dǎo)出HBsAg特異性CIK，增強(qiáng)各自的療效。干擾素是治療CHB常用的抗病毒藥物，主要通過抑制病毒復(fù)制實(shí)現(xiàn)抗病毒作用;并有廣泛的免疫調(diào)節(jié)特性，包括激活T輔助細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞等，進(jìn)而增強(qiáng)宿主對病毒的免疫應(yīng)答。本研究表明，對CHB患者行CIK自體回輸，可有效增強(qiáng)其DC功能，激活細(xì)胞免疫，促進(jìn)病毒清除。兩組患者治療后肝功能、HBV-DNA及HBeAg定量均明顯改善，以觀察組改善明顯。提示利用HBsAg致敏的DC誘導(dǎo)特異性CIK增殖，有望成為臨床治療HBV持續(xù)性感染的新途徑。

綜上所述，DC、CIK回輸是治療CHB的有效療法，其可有效地改善患者的肝功能，促進(jìn)肝臟儲備能力恢復(fù)，清除HBV;DC、CIK聯(lián)合干擾素治療CHB療效更佳。

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