陳劍秋 ，朱敏輝，邱曉霞，夏思文，劉 達，陳世彩，鄭宏良

(1濟南軍區(qū)總醫(yī)院，濟南250031;2第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院)

95%的喉癌為鱗狀細胞癌。復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移是喉癌患者死亡的主要原因。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟和多基因參與的復(fù)雜過程?；蚋淖冐灤┝四[瘤病變的全過程。因而，從基因水平控制喉癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，是提高療效的關(guān)鍵。骨橋蛋白(OPN)是首先在骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一種分泌型鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，其中含有特異的與細胞黏附有關(guān)的RGD序列，通過其受體整合素、CD44等來促進細胞的趨化、黏附、遷移和增殖，從而介導(dǎo)腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移［1］。RNA干擾(RNAi)是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA誘發(fā)的在mRNA水平上的基因沉默機制，可以有效并特異地抑制靶基因的表達［2］。本研究首先觀察了喉鱗狀細胞癌(LSCC)組織中OPN的表達變化;然后通過RNAi技術(shù)下調(diào)喉癌Hep-2細胞中OPN的表達，觀察該細胞增殖和侵襲能力的變化?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 2003年1月～2005年12月經(jīng)病理檢查確診的LSCC患者44例，男40例，女4例;年齡38～76歲。臨床分期(2002年，UICC):Ⅰ期8例，Ⅱ期11例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例。腫瘤分化程度:高分化20例，中分化16例，低分化8例。腫瘤類型:聲門上型14例，聲門型25例，聲門下型5例。所有患者術(shù)前未實施放療和化療。術(shù)中留取癌組織及癌旁正常組織(取自距癌1 cm處的喉組織，病理檢查未見癌細胞浸潤)。上述標(biāo)本常規(guī)制作石蠟包埋切片，厚4 μm。

1．2 主要試劑及細胞株 即用型鼠抗人OPN單克隆抗體，DAB顯色試劑盒，免疫組化SP染色試劑盒，GAPDH抗體，MTT試劑盒，細胞侵襲檢測試劑盒。Hep-2喉癌細胞株，干擾OPN慢病毒載體(LV-shOPN)。

1．3 癌及癌旁正常組織中OPN的檢測 標(biāo)本切片采用免疫組化SP法染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水，樹脂封固，鏡下觀察。細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為OPN陽性細胞。細胞未染色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;陽性細胞百分比＜5% 為0分、5% ～25%為1分、26% ～50%為2分、＞50%為3分。上述2種分值的乘積≤3定為陰性、＞3定為陽性。用已知陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1．4 Hep-2細胞培養(yǎng)及LV-shOPN轉(zhuǎn)染 Hep-2細胞加入含10%胎牛血清的 DMEM，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取適量細胞接種在6孔板中至60% ～70%融合后轉(zhuǎn)染LV-shOPN，培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。LV-shOPN轉(zhuǎn)染后細胞命名為Hep-2-LV-shOPN，轉(zhuǎn)染空載體的細胞命名為Hep-2-LV-shNone。

1．5 細胞OPN檢測 采用Western blot法。收集Hep-2細胞及轉(zhuǎn)染72 h后的Hep-2-LV-shOPN、Hep-2-LV-shNone，PBS洗滌2次，離心棄上清，每孔加入0．2 ml細胞裂解液，冰浴30 min，4 ℃、12 000 g離心20 min，收集上清。取50 μg蛋白質(zhì)加入2×上樣緩沖液，經(jīng)100℃、5 min變性后用10%的SDS-PAGE分離。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液4℃封閉過夜。分別加入 OPN及GAPDH一抗，4℃過夜，TBST洗滌3次，加入二抗(Santa cruz)，室溫孵育1 h，TBST洗滌4次。加顯色劑1 min，X線膠片曝光成像。圖像用Quantity one 4．4軟件進行定量分析。

1．6 細胞增殖活性檢測 采用MTT法。收集培養(yǎng)1、2、3、4、5 d 的 Hep-2 細胞及轉(zhuǎn)染 1、2、3、4、5 d 的Hep-2-LV-shOPN、Hep-2-LV-shNone，分別制成單細胞懸液，按5×103/孔接種于96孔板，每天各取3個復(fù)孔的細胞，用MTT法檢測細胞增殖活性(用OD值表示)。

1．7 細胞侵襲力檢測 采用Transwell小室實驗。取Hep-2細胞及轉(zhuǎn)染72 h后的Hep-2-LV-shOPN、Hep-2-LV-shNone。按照侵襲實驗試劑盒說明，各設(shè)3個復(fù)孔。于Transwell小室的上室加入細胞1×106/孔(無血清培養(yǎng)基的單細胞懸液)，下室加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后用棉拭子將Transwell上室細胞擦去，穿過聚碳酸酯膜的細胞用結(jié)晶紫染色，清水沖洗數(shù)次，空氣干燥后顯微鏡下觀察照相，10×20視野下隨機選取5個視野計數(shù)細胞(代表細胞侵襲力)，取均值。

1．8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15．0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)比較用t檢驗、χ2檢驗。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 OPN蛋白表達及其與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 LSCC組織和癌旁正常組織中OPN陽性表達率分別為 75．0%(33/44)、13．6%(6/44)，兩者相比，P＜0．01。OPN的表達與LSCC臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均＜0．05)，與患者年齡、性別、LSCC臨床類型無關(guān)(P均＞0．05)，詳見表1。

表1 OPN表達與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2．2 Hep-2細胞及轉(zhuǎn)染細胞 OPN表達比較Hep-2、Hep-2-LV-shOPN和 Hep-2-LV-shNone細胞OPN 的相對表達量分別為0．60 ±0．01、0．15 ±0．02和0．54 ±0．02，Hep-2-LV-shOPN 細胞 OPN 的表達量較其他兩種細胞明顯下調(diào)(P均＜0．01)。

2．3 Hep-2細胞及轉(zhuǎn)染細胞的增殖活性 不同時間點 Hep-2、Hep-2-LV-shOPN、Hep-2-LV-shNone細胞的OD值比較見表2。

2．4 Hep-2細胞及轉(zhuǎn)染細胞侵襲力比較 穿過聚碳酸酯膜的 Hep-2、Hep-2-LV-shOPN和 Hep-2-LV-shNone的細胞數(shù)分別為(60．66 ±0．88)、(25．33 ±0．88)和(58．33 ±0．79)個，穿過聚碳酸酯膜的 Hep-2-LV-shOPN細胞數(shù)較其他兩種細胞明顯減少(P均＜0．01)。

表2 不同時間點三種細胞的OD值比較(±s)

表2 不同時間點三種細胞的OD值比較(±s)

注:與 Hep-2、Hep-2-LV-shNone細胞相比，*P ＜0．05

細胞OD值1 d 2 d 3 d 4 d 5 d Hep-2 0．411 ±0．001 0．833 ±0．002 1．123 ±0．001 1．297 ±0．003 1．347 ±0．002 Hep-2-LV-shOPN 0．404 ±0．001* 0．460 ±0．001* 0．605 ±0．003* 0．740 ±0．002* 0．744 ±0．004*Hep-2-LV-shNone 0．365 ±0．003 0．542 ±0．001 0．955 ±0．003 1．075 ±0．004 1．211 ±0．001

3 討論

OPN在多種腫瘤患者的血漿中高表達［3］，因此被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因蛋白。OPN在腫瘤中高表達與乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌、肝癌、直腸癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4～7］，它能夠反映腫瘤惡性程度及轉(zhuǎn)移侵襲能力。

Celetti等［8］研究發(fā)現(xiàn)，LSCC 患者血清中 OPN過度表達。本研究發(fā)現(xiàn)，LSCC組織中OPN的陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，OPN的表達與LSCC臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，OPN陽性表達者惡性程度高、侵襲力強、易發(fā)生轉(zhuǎn)移。提示OPN可作為LSCC的標(biāo)志物及侵襲轉(zhuǎn)移能力的判斷指標(biāo)之一。

RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)，可特異地下調(diào)靶基因的表達。該技術(shù)能快速、高效地阻滯腫瘤細胞或組織中異常、突變蛋白的表達。相對于基因敲除、反義寡核苷酸干擾等技術(shù)，RNAi技術(shù)具有操作更簡單、抑制作用更完全、特異性更高等特點。本研究在體外將OPN基因的RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)染喉癌Hep-2細胞，該細胞中OPN的表達下調(diào)，其增殖活性及侵襲力被抑制。這一結(jié)果為以O(shè)PN為靶點的喉癌基因治療提供了理論依據(jù)。

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