楊卲波 劉海濤 董樹猛 賈賢軍 劉 平

湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院（湖南長沙410005）

內(nèi)分泌治療是目前晚期前列腺癌的首選治療方法，但幾乎所有患者最終都將轉(zhuǎn)化為激素非依賴。以多西他賽為基礎的化療可延長激素非依賴性前列腺癌患者的生存時間，但總體生存時間仍然較短，且副作用大。中醫(yī)藥治療是最常用的替代療法之一。本實驗以本院自制的抗腫瘤中藥菊藻丸，用血清藥理學方法檢測含藥血清對人激素非依賴性前列腺癌細胞PC-3增殖、細胞周期分布的影響，為下一步的動物荷瘤實驗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料成年雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量209～285g，購于中南大學實驗動物中心。菊藻丸（購于我院制劑室，主要藥物為野菊花、海藻、馬錢子、山豆根、黃柏、黃連、莪術(shù)等）10g加三蒸水70mL浸泡24h，過濾，離心取上清液，原藥物質(zhì)量濃度為285.7ng/mL，設 3 個劑量組，即 28.6、2.86、0.286ng/mL。 新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。HAMF-12培養(yǎng)液（含體積分數(shù)10%新生牛血清，青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）為美國Sigma公司產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫檢測儀為Bio-Rad公司產(chǎn)品。人激素非依賴性前列腺癌細胞系PC-3購于上海信然生物技術(shù)有限公司。

1.2 模型制備根據(jù)文獻［1］報道的手術(shù)方法建立去勢模型。用10%水合氯醛注射液按3.5mL／kg劑量作腹腔注射麻醉。碘伏原液消毒、鋪巾。取陰囊部橫切口，依次切開皮膚、肉膜、睪丸壁層鞘膜。將睪丸拉出切口，游離精索，結(jié)扎后切斷，移除標本。先行一側(cè)手術(shù)，然后行對側(cè)手術(shù)，兩側(cè)手術(shù)方法相同。創(chuàng)面止血，縫合切口。手術(shù)當天肌注青霉素100萬U／（kg·d），分3次注射，每8小時1次，第1次于手術(shù)前2h應用。

1.3 含中藥血清的制備將去勢大鼠隨機分為菊藻丸高、中、低劑量組和空白對照組，每組4只。去勢手術(shù)后1周，菊藻丸高、中、低劑量組分別予28.6、2.86、0.286ng／mL菊藻丸水劑灌胃（人-大鼠體表面積等效劑量比率為1∶0.018）；對照組動物以生理鹽水灌胃，均每次4mL，每日2次，共3d。于末次給藥后60～90min，用10%水合氯醛注射液按3.5mL／kg劑量腹腔注射麻醉動物后，均于下腔靜脈取血，置于無抗凝管內(nèi)。室溫下靜置30min，待凝血堅固，血清析出。按1200g離心15min后，吸出上清即為含藥血清或空白血清。同組血清混合，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細胞培養(yǎng)按常規(guī)方法復蘇PC-3細胞系，接種于HamF-12培養(yǎng)液的75cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃、體積分數(shù)5%及飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3日更換培養(yǎng)液1次，70%～80%滿時傳代，傳代時用 2.5g／L 胰蛋白酶。

1.5 MTT法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期細胞，用HamF-12培養(yǎng)液稀釋成2.5×104/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200μL，培養(yǎng)24h，待細胞貼壁。棄去培養(yǎng)液，分別加入含藥血清或空白血清的 Ham F-12培養(yǎng)液 180μL， 分別培養(yǎng) 0、20、44、68h。每孔加入 20μL MTT（5mg/mL），再培養(yǎng) 4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，待甲臜完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長570nm處調(diào)零后讀取光密度（D值）。每組每時段均設10個重復孔，細胞存活率=（含藥血清孔D值／空白血清孔D值）×100%。

1.6 細胞周期的檢測取對數(shù)生長期細胞，用HamF-12培養(yǎng)液稀釋成5.0×104/mL的細胞懸液，接種于6孔板中，每孔3.0mL，培養(yǎng)24h，待細胞貼壁。棄去培養(yǎng)液，分別加入含藥血清或空白血清的HamF-12培養(yǎng)液3mL。培養(yǎng)48h后，經(jīng)消化、離心收集細胞，PBS洗滌2次，70%冷乙醇固定過夜。上機前細胞經(jīng)PBS洗滌 2次后加入 RNaseA （0.1mg/mL）， 放置 37℃孵育30min，碘化丙碇染色，用流式細胞儀測定細胞周期。采用CellQuest軟件分析周期的百分數(shù)，重復5次。

1.7 統(tǒng)計學處理應用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。 結(jié)果以（±s）表示，采用方差分析比較組間差異，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各時段各組細胞的光密度各組細胞的光密度隨培養(yǎng)時間延長均呈增加趨勢 （見圖1）。

圖1 各組細胞光密度曲線圖

2.2 各組含藥血清對PC-3存活率的作用見表1。3組含藥血清處理PC-3細胞4h，細胞存活率均升高，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義。處理24h，含藥血清中、低劑量組存活率升高，高劑量組存活率降低，與中、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。處理48h，含藥血清低劑量組存活率升高，高、中劑量組存活率降低，高劑量組與低劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），處理72h低劑量組存活率升高，高劑量組和中劑量組細胞存活率降低，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）。低劑量組處理4、24、48、72h，細胞存活率均升高，各時間段間差異無統(tǒng)計學意義。中劑量組處理4、24h，細胞存活率升高；處理48、72h，細胞存活率降低，二者相比差異無統(tǒng)計學意義；處理72h與4、24h 比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 高劑量組處理 4h，細胞存活率升高，處理24、48、72h，細胞存活率降低，與處理4h相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且處理72h與處理24h相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），前者細胞存活率降低更明顯。

表1 各組含藥血清對PC-3存活率的影響 （%，±s）

表1 各組含藥血清對PC-3存活率的影響 （%，±s）

與含藥血清高劑量組同時期比較，*P＜0.05；與本組72h時比較，△P＜0.05。

組 別 n 4h 24h含藥血清高劑量組 10 110.40±13.80△ 87.40±7.50△48h 81.50±6.20含藥血清中劑量組 10 101.60±12.70△ 108.50±21.60*△97.20±14.80含藥血清低劑量組 10 103.20±12.40 106.40±20.30*72h 77.30±9.50 82.40±10.90*110.30±16.80*115.40±13.50*

2.3 各組含藥血清對PC-3細胞周期的作用見表2。含藥血清各組的細胞周期分布與空白血清組相比差異均無統(tǒng)計學意義。含藥血清中、低劑量組G1-G0期細胞比例增多，與高劑量組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。高劑量組G2／M期細胞比例比中劑量組高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表2 各組含藥血清對PC-3細胞周期的作用 （±s）

表2 各組含藥血清對PC-3細胞周期的作用 （±s）

與含藥血清高劑量組同細胞周期比較，*P＜0.05。

組 別 n G1-G0（%） S（%）空白血清組 5 61.30±1.80 23.30±0.50含藥血清高劑量組 5 59.10±5.60 22.30±3.10 G2/M 15.50±2.50 18.60±4.30含藥血清中劑量組 5 66.40±1.70* 20.40±4.20 13.40±3.60*含藥血清低劑量組 5 65.20±1.60* 18.50±2.80 15.60±2.70

3 討 論

現(xiàn)有文獻報道的關(guān)于中藥體外實驗的研究大多數(shù)是利用中藥復方或單味中藥的提取物直接加入體外培養(yǎng)體系。這不僅與臨床應用中藥復方水煎劑治療有差異，而且不能反映藥物經(jīng)機體代謝后活性成分改變，及藥物作用后機體免疫力的改變。日本學者Iwama等［2］率先提出“血清藥理學方法”。 此法是將中藥給動物灌胃一定時間后，采集動物血液分離血清，用含藥血清進行體外實驗。這種方法不僅防止了中藥本身理化性質(zhì)（pH、滲透壓、無機鹽離子、鞣質(zhì)等）對體外實驗的干擾，又模擬了藥物在體內(nèi)對細胞生物特性的影響；不僅反映了藥物可吸收部分的直接作用，而且能反映藥物在機體作用下所產(chǎn)生的代謝物質(zhì)和藥物所誘生的機體內(nèi)源性物質(zhì)的間接效應，實現(xiàn)了體外與體內(nèi)實驗的完美結(jié)合。

前列腺癌的中醫(yī)辨證論治可分為濕熱蘊結(jié)證、瘀血內(nèi)阻證、陰虛內(nèi)熱證、腎氣虧虛證。前列腺癌治療主要采用活血化瘀、清熱利濕、軟堅散結(jié)和補腎利尿等方劑。菊藻丸本著“堅者削之、客者除之，結(jié)者散之，留者攻之”之理，選用野菊花、黃連、黃柏、山豆根等清熱燥濕、解毒消腫，臣以莪術(shù)、馬錢子破血行瘀，通絡消積止痛 ，佐以海藻軟堅散結(jié)。實驗提示其可能是通過提高或保護自然殺傷細胞的活性而發(fā)揮抗腫瘤作用［3］。有關(guān)藥理研究表明［4-5］，野菊花、黃連、山豆根、莪術(shù)、馬錢子、海藻等均具有抗腫瘤細胞作用，可抑制癌細胞嘌呤及核酸的合成，對腫瘤細胞有直接殺傷作用。

本實驗中高、中劑量的含藥血清可抑制PC-3細胞的生長，且隨作用時間的延長其抑制作用也隨之增強，而低劑量組含藥血清無明顯抑制作用 ，考慮為藥物質(zhì)量濃度過低所致。以上結(jié)果表明菊藻丸對PC-3細胞有一定的抑制作用，且存在一定的量效、時效關(guān)系，由此表明菊藻丸有明顯的細胞毒作用，可直接抑制癌細胞的生長。

本次實驗的細胞周期分析表明，各處理組PC-3細胞的各期細胞比例與空白血清組相比差異無統(tǒng)計學意義。但中、低劑量組和G1期細胞比例比高劑量組高，差異有統(tǒng)計學意義。高劑量組G2期細胞比例比中劑量組高，差異有統(tǒng)計學意義；細胞G1期比例高可能是（1）細胞周期阻滯的結(jié)果，（2）其他時相（S期和G2／M 期）細胞的優(yōu)先持續(xù)死亡，（3）二者同時起作用的結(jié)果［6］。G2期細胞比例增加，與細胞停滯于G2/M期細胞檢查點有關(guān)。各含藥血清組與空白血清組相比對PC-3細胞周期影響不明顯，但三者之間卻表現(xiàn)差異。提示各含藥血清組與空白血清組對PC-3細胞周期作用機制可能不同，具體機制有待進一步闡明。

菊藻丸是我院已故外科教授肖梓榮行醫(yī)60余年治療惡性腫瘤的經(jīng)驗方，臨床應用于多種惡性腫瘤的治療，療效確切。本研究結(jié)果表明菊藻丸可抑制PC-3細胞的生長，為應用菊藻丸治療雄激素非依賴性前列腺癌的進一步研究提供了依據(jù)。

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［4］鄭虎占，董澤宏，余靖.中藥現(xiàn)代研究與應用［M］.北京：學苑出版社，1997：551，783，4014，4055.

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