劉文龍 ，張喜利 ，賀福元 ，王海琴 ，江星明 ，石繼連 ，楊巖濤 ，包小燕 ，陳作紅 *

（1.湖南師范大學(xué)生科院，湖南 長沙 410081；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

中藥植物體為了維持有機(jī)體正常生存條件和抵御外界不利環(huán)境因素而進(jìn)行著一系列的代謝活動，其代謝活動分為初生代謝和次生代謝。初生代謝生成了葉綠素、糖類、蛋白質(zhì)等維持其生存所必需的初生代謝產(chǎn)物；次生代謝是為了應(yīng)激某種反應(yīng)或者適應(yīng)生存環(huán)境的某種變化而代謝生成了許多中間體或最終產(chǎn)物，即中藥（有效）成分。自然界的生物都是在“遺傳”的基礎(chǔ)上不斷的“變異”以適應(yīng)周圍生存環(huán)境。中藥的種植生長過程亦是一個遺傳變異過程，遺傳使得中藥的品種不變，變異使得中藥成分變化，這是一個自然規(guī)律，是任何改變外部因素所不能改變或者是控制的。因此，在傳統(tǒng)的質(zhì)控模式的基礎(chǔ)上，應(yīng)進(jìn)一步揭示并利用此規(guī)律來控制中藥材的質(zhì)量。

魚腥草為三白草科植物蕺菜Houttuyniae cordata Thunb.的新鮮全草或干燥地上部分。其性辛、微寒,具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋等功能。主要應(yīng)用于肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢、熱淋、癰瘡腫毒等癥[1]。目前,市場上已有以魚腥草為原料的諸多現(xiàn)代制劑廣泛應(yīng)用于臨床，然而因原料的質(zhì)量差異導(dǎo)致成藥質(zhì)量不穩(wěn)定，其中魚腥草注射液因出現(xiàn)免疫毒性而停止生產(chǎn)使用。

近年來，有關(guān)利用RAPD或ISSR標(biāo)記對不同產(chǎn)地魚腥草種質(zhì)資源遺傳多樣性方面的研究已見報(bào)道[2-5]，闡明了不同產(chǎn)地魚腥草存在明顯的基因多態(tài)性現(xiàn)象，合理解釋了道地藥材與GAP質(zhì)控的科學(xué)性。而本文以單株魚腥草為模型中藥，聯(lián)合應(yīng)用ISSR和RAPD標(biāo)記對同一GAP產(chǎn)地魚腥草株間基因多態(tài)性展開研究，旨在進(jìn)一步揭示在完全相同的外部因素（環(huán)境因素）下遺傳基因多態(tài)性規(guī)律，為中藥的質(zhì)量穩(wěn)定性控制提供一種新的思路與方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

魚腥草采自湖南懷化同一GAP產(chǎn)地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室老師鑒定，采取新鮮完整植株，于－70℃冰箱保存。

1.2 試劑

ISSR引物和RAPD引物由北京擎科新業(yè)生物科技有限公司合成，植物DNA快速提取試劑盒和PCR擴(kuò)增所需試劑均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 儀器

DK-8D電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TGL-16G型低溫高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造）；LDZX-30KBS立式壓力蒸氣滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；CM-230超純水系統(tǒng)（北京帕思特科技有限公司）；Biophotometer核酸蛋白分析儀 （德國 Eppendorf公司）；5332型 Eppendorf PCR儀 （香港艾本德中國有限公司）；DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；GZS-1000B型凝膠圖像處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNA提取及檢測

采用康為世紀(jì)生物科技有限公司的植物DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA,并稍加改進(jìn)。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其降解情況,并用Biophotometer核酸蛋白分析儀測定DNA的濃度和純度。

2.2 引物篩選

選取魚腥草DNA模板量多、電泳結(jié)果清晰的5個模板用于引物篩選，分別為 y6、y17、y26、y39、y43，采用不同產(chǎn)地魚腥草研究中具有多態(tài)性的RAPD[2]和ISSR引物[5]各23條來進(jìn)行篩選，從中選取擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰的引物作為正式擴(kuò)增。

2.3 ISSR-PCR分析

ISSR反應(yīng)體系：總體積25 μL，其中Taq Master Mix （2× ）12.5 μL，Rnase-Free water 9.5 μL，DNA 模板（70 ng/μL）1.0 μL，引物 2.0 μL（10 μM）所有操作均在冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，52℃退火1 min （不同引物退火溫度不同），72℃延伸90 s共35個循環(huán)，然后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在110 V電壓下，1.2%瓊脂糖凝膠電泳1 h，電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)中照相并保存。

2.4RAPD-PCR分析

RAPD反應(yīng)體系：總體積 25 μL，其中 Taq Master Mix（2×）12.5 μL，Rnase-Free water 9.5 μL，DNA 模板（90 ng/μL）1.0 μL，引物 2.0 μL（10 μM）所有操作均在冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序如下：94℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，37 ℃退火 1 min，72 ℃延伸90 s共40個循環(huán),然后72℃延伸10 min，4℃保存。電泳及檢測條件同ISSR。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所得到的ISSR和RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性,根據(jù)各分子標(biāo)記的電泳遷移率及其有無統(tǒng)計(jì)所有的二元數(shù)據(jù)，按DNA記條帶的“有”或“無”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶（擴(kuò)增陽性）為“1”，無帶（擴(kuò)增陰性）記為“0”，強(qiáng)帶和弱帶的賦值均為1，形成0/1矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。用NTSYS2pc軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換,得到NTS數(shù)據(jù)表,用similarity項(xiàng)下的qualitative data按SM進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算,所得數(shù)據(jù)表再在clustering項(xiàng)下按非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行SAHN聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 引物篩選結(jié)果

通過引物篩選,得出了符合要求的ISSR引物9條,RAPD引物8條作為正式擴(kuò)增,引物名稱、序列和多態(tài)位點(diǎn)百分比率見表1。從中可以發(fā)現(xiàn)ISSR引物擴(kuò)增的多態(tài)性百分比率普遍高于RAPD引物。

表1 正式擴(kuò)增的引物名稱、序列和多態(tài)性比率

3.2 ISSR和RAPD擴(kuò)增結(jié)果

兩種分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果見表2，本實(shí)驗(yàn)從23條ISSR引物中篩選出的9條引物對供試的46份魚腥草進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。引物 U811的擴(kuò)增效果見圖1，擴(kuò)增片段大部分集中在300～3 000 bp，共擴(kuò)增出134條帶，其中有115條帶呈多態(tài)性，多態(tài)性條帶比率為85.8%，擴(kuò)增的條帶數(shù)在12～16之間，平均每條引物擴(kuò)增出14.9條帶。8條RAPD引物對上述同一組供試品擴(kuò)增后,引物S11的擴(kuò)增效果見圖2，擴(kuò)增片段大部分集中在500～3 500 bp，共擴(kuò)增出101條帶，其中有72條帶呈多態(tài)性，多態(tài)性條帶比率為71.3%，擴(kuò)增的條帶數(shù)在5～15之間，平均每條引物擴(kuò)增出12.6條帶。由以上分析可知，兩種標(biāo)記均能有效的揭示出同一GAP產(chǎn)地魚腥草株間存在較豐富的遺傳多樣性，但I(xiàn)SSR標(biāo)記的多態(tài)性～條帶比率稍高于RAPD標(biāo)記。

表2 ISSR和RAPD擴(kuò)增結(jié)果

3.3 ISSR和RAPD標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)分析

采用Nei’遺傳相似性系數(shù)的計(jì)算方法，得到兩種標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果的相似性系數(shù)矩陣。按UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，得ISSR和RAPD樹狀聚類圖，從圖中可以看出相同生態(tài)環(huán)境下不同株的46份魚腥草樣品遺傳多樣性存在較顯著差異。

ISSR標(biāo)記檢測同一GAP產(chǎn)地魚腥草株間的遺傳相似性系數(shù)范圍為 0.543 8～0.903 5，平均為0.678 6，其中2號和3號樣品，6號和10號樣品的遺傳相似系數(shù)最高，表明二者親緣關(guān)系最近；43號和44號樣品的遺傳相似系數(shù)最低，表明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。RAPD擴(kuò)增結(jié)果的遺傳相似性系數(shù)范圍在0.567 5～0.891 8，平均為 0.694 7，其中 44號樣品的遺傳相似系數(shù)最低，8號和9號樣品的遺傳相似系數(shù)最高，表明二者親緣關(guān)系最近。

ISSR標(biāo)記比RAPD標(biāo)記揭示的遺傳相似性系數(shù)范圍廣，而平均遺傳相似系數(shù)小于RAPD。因此，ISSR標(biāo)記比RAPD標(biāo)記更能檢測到相同生態(tài)環(huán)境下不同株魚腥草間有較顯著的遺傳差異。

3.4 ISSR和RAPD標(biāo)記的相關(guān)性分析

為了檢測同組樣品內(nèi)ISSR和RAPD標(biāo)記的相關(guān)程度,利用Mantel檢驗(yàn)對這兩種標(biāo)記的樣品遺傳相似性系數(shù)矩陣進(jìn)行了相關(guān)性分析。檢驗(yàn)結(jié)果表明，兩種標(biāo)記檢測的遺傳相似性在供試的46株魚腥草樣品中呈顯著的相關(guān)（r=0.798 2）。

4 討論

4.1 同一GAP產(chǎn)地魚腥草不同株間的基因多樣性

ISSR和RAPD標(biāo)記顯示出的聚類結(jié)果表明：同一GAP產(chǎn)地的不同株魚腥草在個體水平上都普遍存在著不同程度的遺傳分化，其遺傳相似系數(shù)均在0.57～0.90之間，說明外界環(huán)境只是影響植物基因多態(tài)性的其中一個因素，遺傳因素才是導(dǎo)致植物個體之間差異的根本原因。

4.2 ISSR和RAPD標(biāo)記在揭示基因多樣性上的比較

兩種標(biāo)記方法在多態(tài)性水平及檢測水平上有差異。從擴(kuò)增條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)、多態(tài)性條帶比率上看，ISSR標(biāo)記均稍高于RAPD標(biāo)記；從遺傳相似系數(shù)上分析，ISSR標(biāo)記比RAPD標(biāo)記的遺傳相似性系數(shù)范圍廣，而其平均遺傳相似系數(shù)小于RAPD。因此，ISSR標(biāo)記比RAPD標(biāo)記能反映相對較多的遺傳信息，能檢測到相同生態(tài)環(huán)境下不同株魚腥草間有較高的遺傳差異。但同時(shí)也看到兩種標(biāo)記的反映的遺傳信息是不盡相同的，因此，結(jié)合兩種方法使用更加全面和客觀。

4.3 中藥基因多樣性與其質(zhì)量控制

中藥材為多成分復(fù)雜體系，并具有多效性和整體平衡調(diào)節(jié)性。中藥材質(zhì)量不穩(wěn)定是困擾中醫(yī)藥行業(yè)進(jìn)一步發(fā)展壯大的瓶頸，是中醫(yī)藥專家學(xué)者必須面對并且亟待解決的問題。目前雖然采用指紋圖譜[6,7]、生物效應(yīng)[8]的方法進(jìn)行質(zhì)量控制，在一定程度上對中藥質(zhì)量控制有所幫助，但這均不能從本質(zhì)上解決中藥質(zhì)量的不穩(wěn)定性。只有充分認(rèn)識中藥的遺傳多態(tài)性規(guī)律，并且運(yùn)用這一規(guī)律，結(jié)合以前專家學(xué)者的質(zhì)量控制方法，才能從根本上解決中藥質(zhì)量不穩(wěn)定現(xiàn)象。

迄今，許多學(xué)者已經(jīng)對此作了一些探討，如蘇文華[9]等通過實(shí)驗(yàn)證明，生長在同一生態(tài)環(huán)境下的短葶飛蓬不同個體之間總黃酮含量最高者高出最低者58.40%。張浩[10]等推測同一環(huán)境不同多舌飛蓬之間燈盞乙素含量差異說明其具有遺傳背景。本文以同一GAP產(chǎn)地的魚腥草為模型中藥，在之前的研究基礎(chǔ)上[11,12]，從更深層次（分子水平）揭示生物基因多態(tài)性，進(jìn)一步揭示中藥遺傳多態(tài)性是造成中藥化學(xué)成分不穩(wěn)定的根本原因，從而引起為單株中藥質(zhì)量必定存在一定差異，只有從整體觀念出發(fā)才能控制中藥質(zhì)量穩(wěn)定性，因此本課題組將從Hardy-Weinberg平衡群體角度出發(fā)，建立相關(guān)數(shù)學(xué)模型，最終獲取中藥穩(wěn)態(tài)提取工藝中最小投料量，實(shí)現(xiàn)中藥穩(wěn)態(tài)提取工藝參數(shù)化，為保證中藥(材)質(zhì)量穩(wěn)定性奠定基礎(chǔ)。

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