伍參榮 ，蔡 銳 ，李 珊 ，申可佳 ，賈本真 ，李芳榮

（1.湖南中醫(yī)藥大學病原免疫學教研室，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410006）

結(jié)核病是一種慢性傳染病，近20年來，由于艾滋病的傳播以及耐藥等因素的影響，全球結(jié)核發(fā)病率呈上升勢。目前認為，耐藥性結(jié)核分枝桿菌廣泛傳播是結(jié)核病流行的主要原因[1]，臨床上已發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌菌株對多種一線抗結(jié)核藥物耐藥[2]，因此，研制新型抗結(jié)核藥物有其必要性，從中藥中篩選抗結(jié)核新藥是其有效途徑之一。黃葵素是從天然藥物中篩選出的新型化合物—小檗堿離子對化合物 （專利號：200510136655），研究中發(fā)現(xiàn)該藥能抗多種病原體，特別是抗胞內(nèi)菌感染?，F(xiàn)將其抗結(jié)核桿菌研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 H37RV標準菌 (ATCC：27294)本室保存菌株； 多藥耐藥菌株(INH／R，SM／R，RFP／R，EMB／R，KA/R，IRO/R)編號 005101 由湖南省結(jié)核病院檢驗科提供。從培養(yǎng)基中稱取0.1 mg菌落，加入0.5 mL生理鹽水與蘇通培養(yǎng)液(體積比為1∶3)的混合稀釋液分別接種于改良羅氏培養(yǎng)基[3]斜面上。置37℃培養(yǎng)。18 d后分別取改良羅氏培養(yǎng)基上生長良好的菌落于研磨器中，加少量含0.05%Tween80的生理鹽水研磨均勻，稀釋成白色均勻混濁的菌液。顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細菌濃度為3×107個／mL（供試驗用）。

1.1.2 試驗藥物 黃葵素干粉由湖南中醫(yī)藥研究院藥物研究所提供，批號：20070212，用含2%乙醇生理鹽水稀釋成1 g/mL，4℃保存?zhèn)溆?。利福平膠囊（0.3 g/粒，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號：20061209001），實驗時先用少許乙醇溶解，再用無菌蒸餾水稀釋至5 mg／mL。

1.1.3 動物 KM小鼠70只，SPF級體質(zhì)量 （18.0±2.0）g雌雄各半，購自湖南萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK2009-0004。 飼養(yǎng)于(21±2)℃、濕度(55±15)%、可以方便獲取食物和水的負壓感染動物房內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 體外抗菌實驗[3－4]改良羅氏培養(yǎng)基分別制成含藥和不含藥平皿，即：不含藥的空白對照組；陽性對照組 (利福平5 mg／mL)；含不同濃度黃葵素組(100，50，25， 12.5，6.2，3.2 mg/mL)，各組培養(yǎng)基每平皿15 mL。取上述菌懸液0.1 mL接種于各含藥培養(yǎng)基表面，每個濃度設(shè)5個平皿，置37℃培養(yǎng)，每5 d觀察1次，40 d后以模型對照組結(jié)核分枝桿菌長滿培基表面為終止培養(yǎng)標準，計數(shù)各皿菌落數(shù)。

1.2.2 藥物抑制培養(yǎng)后結(jié)核分枝桿菌恢復培養(yǎng)試驗 經(jīng)含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d后，對無肉眼可見菌落生長的培養(yǎng)基表面物，進行結(jié)核分枝桿菌恢復培養(yǎng)。用生理鹽水洗下無菌落生長的培養(yǎng)基表面顆粒狀物，離心沉淀后接種于改良羅氏培基平皿，37℃培養(yǎng)，每5 d觀察1次，40 d后終止培養(yǎng)，計數(shù)菌落數(shù)，標準菌株H37RV為對照，每濃度做5皿。進一步評價藥物對結(jié)核分枝桿菌的抑制作用。

1.2.3 藥物小鼠體內(nèi)抗菌實驗[5－6]小鼠按體質(zhì)量分層后隨機分為7組，每組10只，分別為正常組、模型組、黃葵素組、陽性藥對照組。除正常對照組外，其他組小鼠造模；每只小鼠尾部靜脈注射0.1 mL經(jīng)0.05%Tween80生理鹽水稀釋的H37Rv菌液，含活菌數(shù)約 3×105個。 （1）正常小鼠對照組(NG)：每只小鼠尾部靜脈注射0.1 mL 0.05%Tween80的無菌生理鹽水。從第2天灌胃生理鹽水1次/d，每周灌胃5次，0.2 mL/只，持續(xù) 6周。（2）模型組：包括標準株

H37RV(MH37RG)和多耐藥株模型（MDNG）對照組：感染1 d后，每只小鼠生理鹽水每天灌胃1次，每周灌胃 5 次，0.2 mL/只/次，持續(xù) 6 周。 （3）陽性藥對照（利福平組RFG）即H37RV(RFH37RG)和多耐藥株(RFDNG)治療組：感染1 d后，每只小鼠利福平150 mg／kg每天灌胃 1次， 每周灌胃 5次，0.2 mL/只/次，持續(xù)6周。④黃葵素治療組（黃葵素組HKSG）即標準株H37Rv(HKSH37RG)和多耐藥株(HKUSDNG)治療組：感染1 d后，每只小鼠黃葵素75 mg／kg灌胃，灌胃前用0.5%黃耆膠制成混懸液，每天灌胃1次，每周灌胃 5次，0.2 mL/只/次，持續(xù) 6周。

1.2.4 藥物對組織載菌量的影響 采用二氧化碳窒息法處死小鼠，75%的乙醇溶液消毒小鼠體表5 min，于生物安全柜內(nèi)解剖小鼠，取脾臟和肺臟，分別置于滅菌研磨器中，每個臟器加2.0 mL無菌生理鹽水勻漿，并進行系列稀釋，每個臟器稀釋5個濃度，每個濃度做3個試管，每管取0.1 mL涂布于改良羅氏培基中，37℃培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，40 d后計數(shù)菌落。

1.2.5 藥物對感染組織病理學的影響 每組隨機取5只小鼠無菌分離出小鼠脾臟和肺臟，置入10%的甲醛溶液固定，蘇木精-伊紅（HE）和抗酸染色切片，觀察感染組織病理變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 黃葵素對結(jié)核桿菌的體外抑殺作用

表1可以看出黃葵素對H37RV標準菌抑殺作用強于多耐藥株，黃葵素100 mg/mL時對H37RV標準菌抑殺作用和利福平比較無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；同樣黃葵素在100 mg/mL時顯示出對臨床多耐藥株的較好的抑殺作用，與利福平組比較，各時間點差別均顯示出統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 黃葵素試管中對結(jié)核桿菌生長的抑制作用 （n=5，±s）

表1 黃葵素試管中對結(jié)核桿菌生長的抑制作用 （n=5，±s）

注：LSD分析P＜0.05，示Q檢驗與模型組比較*P＜0.05；與利福平組比較#P＜0.05。

組 別HKSG1 HKSG2 HKSG3 HKSG4 HKSG5 HKSG6 RFG培基對照模型對照藥物濃度mg/mL 100 50 25 12.5 6.2 3.2 5不同觀察時間H37RV落生長數(shù)（個）10～25 d 30 d 35 d 40 d——— 2.00±0.01* 3.30±1.00* 4.00±1.00*— 6.22±1.21* 7.05±1.02* 9.16±1.87*— 7.65±2.31* 7.65±2.31* 10.00±2.12*— 10.00±1.20* 13.50±2.12*15.00±1.34*— 13.89±3.12* 22.52±3.46*42.00±3.60———— 20.00±2.12 39.00±3.41 41.96±3.33不同觀察時間多耐藥株菌落生長數(shù)（個）10～20 d 25 d 30 d 35 d 40 d— — 2.00±0.02*# 2.00±0.02*# 5.80±0.02*#— 2.00±0.018# 8.01±1.02*# 15.12±2.15*# 31.00±3.00*#— 4.00±1.00*# 12.21±2..038*# 21.33±2.14*# 35.09±3.14*#— 8.00±1.13*# 11.00±2.538*# 22.00±2.63*# 36.00±3.76*#— 8.21±1.26*# 12.00±2.25*# 22.00±2.34*# 36.63±3.15*#— 22.00±2.96# 37.76±3.98*# 39.49±3.46*# 39.49±3.46*#— 19.880±2.36 40.37±2.67 43.00±3.134 43.00±3.13— — — — —— 2 0.00±1.36 39.87±3.10 42.57±3.19 42.57±3.19

藥物試管中抑制培養(yǎng)后的結(jié)核桿菌恢復培養(yǎng)結(jié)果顯示：黃葵素100 mg/mL恢復培養(yǎng)30 d后肉眼觀察無可見菌落生長，40 d時肉眼可見菌落數(shù)為4.02±1.12，而空白管為51.43±3.10，顯示出藥物對H37RV標準菌較好的抑殺作用。

2.2 黃葵素小鼠體內(nèi)抑殺結(jié)核桿菌的作用

表2可以看出黃葵素與利福平治療組與模型組比較均能顯示出較好的抗菌作用（P＜0.05）。黃葵素對H37RV標準菌感染小鼠抑殺作用與RFG組比較無差異（P＞0.05），對多耐藥株感染小鼠體內(nèi)的抑殺作用強于RFG，RFG多耐藥株組小鼠肺組織與脾組織載菌量高于HKSG，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示黃葵素對結(jié)核桿菌多耐藥株有較好的抑殺作用。

2.3 藥物對結(jié)核桿菌感染小鼠組織病理學的影響

（1）藥物對標準株H37Rv感染小鼠肺組織病理學影響 各組肺組織病理切片圖顯示 （圖1～3），治療6周后模型組小鼠正常肺組織結(jié)構(gòu)消失，充血實變，肺泡腔內(nèi)充滿淋巴細胞、巨噬細胞，肺泡間隔不存在，肺部病變嚴重、廣泛，增生性改變不明顯；利福平治療組無明顯的病理改變；黃葵素治療組肺組織結(jié)構(gòu)無明顯的病理變化。高倍鏡下觀察：模型組小鼠肺組織內(nèi)可見圓形的結(jié)節(jié)狀病灶，灶內(nèi)可見較多的上皮樣細胞、淋巴細胞及纖維組織，和多核巨細胞。黃葵素組與利福平組小鼠肺組織高倍鏡下與模型組比較淋巴細胞以及多核巨細胞明顯減少，未見結(jié)節(jié)狀病灶。模型組結(jié)核結(jié)節(jié)內(nèi)可見成簇排列的抗酸桿菌；黃葵素治療組小鼠肺組織抗酸染色菌密度明顯低于模型組，有效減少了肺組織病變部位定植的結(jié)核桿菌數(shù)量。

表2 黃葵素對結(jié)核桿菌感染小鼠肺和脾組織載菌量的影響 （n=10）

（2）藥物對H37Rv感染小鼠脾組織病理學影響模型組小鼠感染H37Rv后脾淋巴小結(jié)增大，脾竇及紅髓的外套叢充血，淋巴細胞增生，淋巴小結(jié)內(nèi)生發(fā)中心增生；黃葵素、利福平組小鼠脾臟淋巴小結(jié)輕度增大，病變程度較模型組小鼠明顯減輕；高倍鏡下模型組小鼠脾組織淋巴小結(jié)內(nèi)淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞浸潤，可見滲出物；黃葵素與利福平組治療組小鼠脾組織淋巴小結(jié)內(nèi)淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞浸潤較模型組小鼠明顯減少，無炎性滲出；模型組脾組織內(nèi)結(jié)核桿菌數(shù)量明顯多于黃葵素組、利福平治療組（圖 4～6）。

（3）藥物對多耐菌株實驗小鼠肺組織病理學影響多耐藥株模型組、利福平組小鼠肺組織正常肺泡結(jié)構(gòu)消失，有彌漫性病變，多個結(jié)核結(jié)節(jié)融合，呈現(xiàn)浸潤型肺結(jié)核表現(xiàn)，肺泡腔內(nèi)可見漿液、單核細胞、淋巴細胞和中性粒細胞，有肺水腫。高倍鏡下肺組織結(jié)核結(jié)節(jié)內(nèi)干酪樣壞死，結(jié)節(jié)的邊緣淋巴細胞和成纖維細胞明顯增多；肺結(jié)核結(jié)節(jié)灶內(nèi)有紫紅色短桿狀微彎曲的桿菌密布。黃葵素治療組未見明顯的結(jié)節(jié)融合與干酪樣壞死，病變部位局限，肺間隔炎癥較輕，肺間質(zhì)及血管周圍炎細胞浸潤少，病變部位抗酸桿菌散在分布，含菌量較模型組、利福平組小鼠減少（圖7～9）。

（4）藥物對多耐菌株實驗小鼠脾組織病理學影響 圖10～13可見模型組、RFG小鼠脾組織內(nèi)脾索及脾竇可見大量的中性粒細胞、單核細胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞；脾索及脾竇破壞嚴重，脾小體萎縮，有多個結(jié)核結(jié)節(jié)，和結(jié)核桿菌。與模型組比較HKSG小鼠脾組織充血，病變較輕，淋巴小結(jié)輕度增大，病變部位的細菌量也較少。

3 討論

結(jié)核病是一種的慢性傳染病，又稱為癆病和“白色瘟疫”。自20世紀90年代以來，結(jié)核病在全球“死灰復燃”，每年有近900萬新發(fā)病例，150多萬人死亡[7]2-5。造成嚴重的公共衛(wèi)生問題和重大的經(jīng)濟社會問題。結(jié)核病呈上升趨勢根本的原因是結(jié)核分支桿菌耐多藥性的產(chǎn)生，使原有的抗結(jié)核病治療方案(即一線抗癆藥，二線抗癆藥治療方案)受到了很大的沖擊，使原有的抗結(jié)核病的治療規(guī)程失去了應有的作用[7]135，[8]。因此，研制新型抗結(jié)核藥物有其必要性。

黃葵素為小檗堿離子對化合物，本次體外抗菌作用研究結(jié)果顯示:黃葵素與利福平組比較，對H37RV標準菌有抑殺作用，兩組差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；但對多耐藥株的抑殺作用均強于利福平組，各時間點差別均顯示出統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

通過尾靜脈注射結(jié)核桿菌建立小鼠結(jié)核感染模型[9-10]觀察感染小鼠組織的病理變化，研究表明黃葵素能明顯減輕小鼠肺、脾組織的結(jié)核病理損傷，以及減少細菌在組織內(nèi)的定植。對結(jié)核分枝桿菌標準株感染鼠臟器的保護與利福平作用相當 （P＞0.05）；更重要的是黃葵素能有效的殺滅定植在小鼠體內(nèi)的多耐藥結(jié)核菌，減輕耐藥細菌對臟器的損害程度。

器官載菌量是動物實驗中觀察抗結(jié)核感染療效的重要指標[11]，本次研究結(jié)果表明：藥物治療60 d后，黃葵素與利福平治療組均能顯示出較好的抗菌作用，兩組間差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；對小鼠體內(nèi)感染的多耐藥株菌抑殺作用黃葵素強于利福平，多耐藥株利福平治療組小鼠肺組織載菌量比黃葵素組高2.01（P＜0.05），脾臟組織載菌量比黃葵素組高1.19（P＜0.05），提示黃葵素對感染機體的多耐藥結(jié)核桿菌有較好的抑殺作用。

綜上所述，從天然藥物中篩選出的離子對化合物黃葵素在體內(nèi)外均顯示出較好的抗結(jié)核桿菌作用，其機理值得深入探討。

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