王少清,葉 凱,王佳偉

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,福建 泉州 362000;2.福建醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 ,福建 泉州 362000)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。盡管在胃癌以手術(shù)為主的綜合治療方面取得了許多進(jìn)展,但是5年生存率仍然徘徊在30%～40%左右。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血行轉(zhuǎn)移是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)趨化因子受體(CXCR4)在某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá),并在腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測 CXCR4蛋白在胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織及肝轉(zhuǎn)移組織中 CXCR4蛋白的表達(dá),同時應(yīng)用 RT-PCR檢測其 CXCR4mRNA在 4株胃癌細(xì)胞株中的表達(dá),探討其與臨床病理特征的關(guān)系,以及對預(yù)后的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

胃癌標(biāo)本來自我院 2007— 01～ 2008— 12收治的胃癌患者,64例均經(jīng)手術(shù)治療術(shù)后病理確診為胃癌,臨床資料完整?；颊咴谑中g(shù)前未接受化療或者放療并且簽署知情同意書。其中男 35例 ,女 29例 ;年齡 20～ 82歲 ,中 位年齡 56歲。組織 學(xué)分級:高分化腺癌 18例,中分化腺癌25例,未分化、低分化腺癌21例 ;浸潤深度 T(1997年 UICC)T16例 ,T222例 ,T38例 ,T48例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 34例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 30例;有肝轉(zhuǎn)移18例。術(shù)中采集胃癌組織及正常胃黏膜作為對照(距腫瘤邊緣大于5cm),以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌、肝轉(zhuǎn)移組織(均經(jīng)病理證實(shí) )。4株人胃癌細(xì)胞分別為 SGC-7901,BGC-823,NCI-N87及SNU-1細(xì)胞株,均采用含 10%小牛血清的 RPM I1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于5%CO2飽和濕度37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑、儀器

試劑:兔抗人 CXCR4抗體(BA0761)購自武漢博士德,免疫組化 Elivision plus試劑盒(KIT-9901)、檸檬酸組織抗原修復(fù)液、PBS、DAB購自福州邁新。 Trizol、DEPC購自Invitrigeon公 司,CXCR4引 物 序 列 (上 游 5'-CTGGAGAACCAGCGGTTACC- 3',下 游 5'-CCATGATGTGCTGAAACTGG-3',產(chǎn)物 639bp)及內(nèi)參引物 序 列 (β- actin上 游 5'-ATCATGT TTGAGACCTTCAACA- 3',下 游 5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3',產(chǎn)物 318bp)由北京三博遠(yuǎn)志公司合成。儀器:高速冷凍離心機(jī)(TGL-16G),PCR儀 (美國 PE2400),凝膠電泳儀 (DYY-Ⅲ 8B),凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法和結(jié)果判斷

①免疫組化染色采用 PowerVisionTM兩步法進(jìn)行染色。4μm切片經(jīng) EDTA緩沖液 (pH8.0)微波修復(fù)15min,CXCR4兔抗血清,PBS代替一抗作陰性對照,DAB顯色 ,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片。染片背景清晰,以細(xì)胞膜和(或 )胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標(biāo)志,陽性細(xì)胞數(shù)大于20%以上的組織切片視為陽性表達(dá)。②逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 人胃癌細(xì)胞株、胃癌組織總 RNA的提取按 T RZOL操作說明進(jìn)行 ,取3μ g總 RN A,加入隨機(jī)引物 oligo(dT)181 μL,去離子水補(bǔ)充至 12μL于 70℃孵育 5min,依次加入 5× reaction buffer4μL、Rnasin(20U/μL)1μL、10mM dN TPs2μL于 37℃孵育 5min,添加 M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶 (200U/μL)1 μL,42℃反應(yīng) 60min以合成 cDN A第一鏈,70℃孵育10min終止反應(yīng);以此 cDNA為模板行 PCR,反應(yīng)體系:10× PCR緩沖液 2.5μL、10mM dNTPs 0.5 μL、 25mM MgCl22.0 μL、10μM的上下游引物各1μ(10μM),Taq DN A聚合酶 (1U/μL)2 μL,去離子水補(bǔ)充總體積至 25μL。反應(yīng)條件:94℃變性45s,60℃復(fù)性 45s,72℃延伸50s,30個循環(huán),72℃再延伸5min。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,凝膠成像系統(tǒng)攝像保存分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

患者隨訪3年以上,記錄的生存時間為自手術(shù)時間至末次隨訪或死亡時間,或隨訪數(shù)據(jù)庫截至的時間,數(shù)據(jù)輸入SPSS11.5軟件包,計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),生存率用 Kap lan-Meier方法分析,生存率比較采用 Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4蛋白在正常胃組織、胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織和肝轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)

CXCR4主要表達(dá)在胃癌細(xì)胞的胞膜及胞漿中,呈均勻的棕黃色顆粒狀染色。本研究結(jié)果顯示,CXCR4在胃癌組織的陽性表達(dá)高于癌旁組織,其陽性率分別為51.5%及15%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。肝轉(zhuǎn)移組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)CXCR4表達(dá)陽性率分別為72.2%及73.5%),轉(zhuǎn)移組織陽性表達(dá)率明顯高于原發(fā)腫瘤。

2.2 CXCR4mRN A在人胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)

CXCR4mRN A在 4株細(xì)胞株中的 2株 (SGC-7901和BGC-823細(xì)胞株)中高表達(dá),而在正常胃癌組織、NCI-N87及和 SNU-1細(xì)胞株中低表達(dá)。

2.3 CXCR4蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特性的關(guān)系

胃癌組織 CXCR4陽性表達(dá)率與 TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān),差別有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。CXCR4陽性表達(dá)率與患者年齡、性別、浸潤深度、腫瘤所在部位及病理分化程度等臨床病理特性間差異無顯著性(P ＞ 0.05)。見表1。

表1 免疫組化法檢測胃癌 CXCR4值與臨床病理因素之間的關(guān)系

?

2.4 胃癌組織 CXCR4表達(dá)水平與生存率的關(guān)系

CXCR4陽性表達(dá)胃癌組3年生存率為45.7%,明顯低于CXCR4陰性表達(dá)組61.4%,兩組生存率間差異有顯著性意義(P ＜ 0.05)。

3 討論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤晚期的主要癥狀和致死原因,是一個有序、復(fù)雜、非隨機(jī)的過程,有器官選擇性,并與淋巴細(xì)胞歸巢和白細(xì)胞游走可能存在相似機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),趨化因子及其受體在惡性腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用,趨化因子受體 CXCR4與其特異性配體 CXCL12所構(gòu)成的 CXCR4/CXCL12生物軸在腫瘤的播散和器官特異性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。趨化因子受體 CXCR4在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用已分別在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、胃癌等研究中得到證實(shí)[1～5]。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體 CXCR4,從而易于向表達(dá)其配體的器官轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞從母瘤上脫落后,經(jīng)遷徙,容易趨向并滯留于表達(dá) CXCR4配體的部位 (淋巴結(jié)、肝、肺等),在其內(nèi)增殖而形成轉(zhuǎn)移瘤。目前關(guān)于胃癌中趨化因子CXCR4表達(dá)及其在轉(zhuǎn)移中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)CXCR4/CXCL12在胃癌組織中高表達(dá),正常黏膜 CXCR4/CXCL12呈低表達(dá),CXCR4在肝轉(zhuǎn)移組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中高于原發(fā)腫瘤。提示:CXCR4陽性表達(dá)與胃癌的生長、轉(zhuǎn)移有關(guān)。胃癌細(xì)胞株 CXCR4的表達(dá)是不均勻的,部分高表達(dá),部分低表達(dá)或不表達(dá),這也可解釋胃癌患者生物學(xué)行為類似,部分易淋巴及血行轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步研究 CXCR4的陽性表達(dá)與胃癌臨床病理特性的關(guān)系發(fā)現(xiàn):CXCR4的表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān),而與腫瘤分化程度、浸潤深度及部位等無關(guān)。提示:趨化因子受體 CXCR4主要在腫瘤轉(zhuǎn)移中的起重要作用(包括淋巴結(jié)、血行轉(zhuǎn)移),而腫瘤浸潤中的作用并不明顯。Mashino[5]對 68例胃癌研究發(fā)現(xiàn):趨化因子與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴管浸潤有關(guān),CXCR陽性胃癌患者預(yù)后較差,回歸分析顯示 CXCR陽性是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素之一。本研究顯示 ,伴區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者 CXCR4陽性率顯著高于無區(qū)域轉(zhuǎn)移的胃癌患者 (P＜0.05),淋巴結(jié)組織 CXCR4陽性率顯著高于胃癌組織 (P＜0.05),提示CXCR4陽性表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Sumiya[6]在胃癌研究發(fā)現(xiàn),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的 CXCL12和CXCR4陽性表達(dá)均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織。Tamamura等[7]的研究發(fā)現(xiàn) CXCL12的抑制劑 T140類似物在體外實(shí)驗(yàn)中能有效的抑制 CXCL12誘導(dǎo)的人乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231的侵襲,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可以降低 MDA-MB-231SCID小鼠接種后肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

CXCR4陽性組預(yù)后差的主要原因可能是由于發(fā)生胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。肝臟是胃癌最常見的轉(zhuǎn)移部位,由于手術(shù)中無法準(zhǔn)確判斷有否微小轉(zhuǎn)移灶存在,因此如何預(yù)測肝轉(zhuǎn)移并早期診斷、及時治療是目前影響胃癌治療效果的主要環(huán)節(jié)。本研究顯示伴肝轉(zhuǎn)移的胃癌患者 CXCR4陽性表達(dá)率72.2%(13/18)顯著高于無肝轉(zhuǎn)移的患者 43.5%(20/46),CXCR4陽性表達(dá)組 3年生存率為61.7%,明顯低于 CXCR4陰性表達(dá)組73.9%。提示胃癌組織 CXCR4陽性表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān),CXCR4陽性表達(dá)患者預(yù)后較差。Yasumoto等[8]的研究也顯示,CXCR4表達(dá)陽性的原發(fā)性胃癌與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移有高度相關(guān)性,應(yīng)用 CXCR4拮抗劑 AM D3100可有效抑制胃癌細(xì)胞的腹膜轉(zhuǎn)移及腹水生成。Liang等[9]通過小分子干擾核糖核酸技術(shù)(siRNA)從 mRN A水平阻斷 CXCR4的表達(dá)后削弱了乳腺癌細(xì)胞在重組細(xì)胞基底膜侵襲抑制實(shí)驗(yàn)中的侵襲能力并且在動物實(shí)驗(yàn)中阻止乳腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

本研究顯示趨化因子家族影響著腫瘤的生長、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。檢測胃癌細(xì)胞趨化因子受體 CXCR4成員有助于判斷患者轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā),這將完善胃癌分子生物學(xué)分期系統(tǒng),并且有助于篩選治療胃癌的靶基因通過阻斷趨化因子 CXCR4/CXCL12通路,有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

[1] Spano JP,Andre F,Morat L,et al.Chemokine receptor CXCR4 and early-stage non-small cell lung cancer:Pattern of expression and correlation with outcome[J].Ann Oncol 2004,15(4):613-617

[2] Koshiba T,Hosotani R,Miyamoto Y,et al.Expression of stromal cell-derived factor1and CXCR4ligand receptor system in pancreatic cancer:a possible role for tumor progression[J].Clin Cancer Res 2000,6(9):3530-3535

[3] 王正林,胡祥,梁品,等.趨化因子受體 CXCR4在胃癌中的表達(dá)及其意義 [J].中華普通外科雜志,2009,18(12):1275-1279

[4] Kato M,Kitayama J,Kazama S,et al.Expression pattern of CXC chemokine receptor-4 is correlated with lymph node metastasis in human invasive ductal carcinoma[J].Breast Cancer Res,2003,5(5):144-150

[5] Mashino K,Sadanaga N,Yamaguchi H,et al.Expression of chemokine receptor CCR7 is associated with lymph node metastasis of gastric carcinoma[J].Cancer Res,2002,62(5):2937-2941

[6] Sumiyai,Shojin,Hiroshio,et al.Clinical implication of CXCL12 expression in gastric cancer[J].Ann Surg Oncol,2007,14(11):3154-3158

[7] Tamamura H,Hori A,Kanzaki N,et al.T140analogs as CXCR4 antagonist s identified as anti2metastatic agents in the treatment of breast cancer[J].FEBS Lett,2003,550(1～3):79-83

[8] Yasumoto K,Koizumi K,Kawashima A,et al.Role of t he CXCL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gast ric cancer[J].Cancer Res,2006,66(4):2181-2187

[9] Liang Z,Yoon Y,Votaw J,et al.Silencing of CXCR4 blocks breast cancer metastasis[J].Cancer Res,2005,65(3):967-971