顧鏡月,王鳳娟

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)在讀研究生,黑龍江 佳木斯 154007)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是圍生期最常見的疾病,它不僅威脅新生兒的生命,而且有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]。血腦屏障破壞引起的血管源性腦水腫是 HIE最常見的病理改變?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9MM P-9)是蛋白水解酶家族之一,可以降解血腦屏障的基本結(jié)構(gòu)-基膜,與血腦屏障的損傷導(dǎo)致血管源性腦水腫關(guān)系密切[2]。其活性主要受內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的抑制,但由于基質(zhì)金屬蛋白酶具有高度保守的同源序列,其特異性抑制劑人工重組很困難,因此尋找一種安全可靠的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑可能為治療 HIE提供一個方向。丙酮酸乙酯是一種安全、穩(wěn)定的脂溶性丙酮酸衍生物,近幾年研究表明[3]在多種疾病動物模型中有抗炎抗氧化等器官保護(hù)作用 ,但其對 MMP-9在新生大鼠腦損傷的影響目前國內(nèi)尚無報道。本實驗利用新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型,應(yīng)用免疫組化法觀察 MMP-9陽性細(xì)胞數(shù),探討丙酮酸乙酯對 MM P-9表達(dá)的影響及腦保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

7日齡清潔級 Wistar大鼠(12.5g～ 16g)90只由佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供,不分雌雄隨機分為三組:陰性對照組;缺血缺氧組 (HIBD組);丙酮酸乙酯治療組(EP組),每組再分為 6h、24h、48h、72h、5d,5個亞組。

1.1.2 主要試劑

混合氣體(O:8%,N:92%)購于佳木斯市金鼎氧氣廠,丙酮酸乙酯購于 Sigma公司,MM P-9濃縮型兔多克隆親和純化抗體購于武漢博士德生物工程有限公司,SABC(兔IgG)-AP kit試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司,PBS購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腦缺血缺氧模型制備

參照 Rice[4]方法,將新生 7日齡清潔級 Wistar大鼠乙醚麻醉后,做永久性左側(cè)頸總動脈結(jié)扎,術(shù)后放回母鼠處恢復(fù)2h。然后,放入缺氧艙內(nèi)封閉氧艙,通入缺氧混合氣體(O:8%,N:92%)2h。HIBD組于缺血缺氧后10min腹腔注射生理鹽水1.5mL。EP組大鼠于缺血缺氧后10min腹腔注射丙酮酸乙酯溶液(50mg/kg)[5]。

1.2.2 取材及切片制作

兩組大鼠分別在缺血缺氧后的不同時間點灌注處死、斷頭取腦。取出的大腦放置于4%多聚甲醛內(nèi)固定,4℃冰箱內(nèi)保存。將固定好的大腦標(biāo)本進(jìn)行修塊,梯度酒精脫水,二甲苯透明,液體石蠟包埋。用石蠟切片機做連續(xù)冠狀切片。

1.2.3 HE染色

石蠟切片經(jīng)脫蠟→水化→蘇木精染色→流水沖洗→鹽酸酒精分色→藍(lán)化→伊紅染色→梯度酒精脫水→二甲苯透明→中性樹膠封片。

1.2.4 免疫組化染色

按照 SABC-AP免疫組化染色試劑盒說明操作,一抗為濃縮型兔多克隆親和純化 MM P-9抗體(稀釋度1:100).陽性細(xì)胞著色表現(xiàn)為胞漿 /胞膜染成棕褐色,采用陽性細(xì)胞計數(shù)法,每張切片在400倍物鏡下隨機選取不重復(fù)的6個視野,計數(shù) MMP-9陽性細(xì)胞數(shù),取平均值為該張片子的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用方差分析 ,均數(shù)間兩兩比較采用 t檢驗,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色腦組織病理改變

對照組腦結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞形態(tài)正常層次分明;HIBD組細(xì)胞腫脹,神經(jīng)元排列紊亂,核固縮、裂解,胞漿淡染,可見壞死液化灶及點狀出血;EP組細(xì)胞水腫較 HIBD組減輕,未見壞死灶 (圖 1)。

圖1 腦組織 HE染色(×40)

2.2 MM P-9免疫組化結(jié)果

對照組 MM P-9微量表達(dá),HIBD組 MM P-9陽性細(xì)胞呈胞質(zhì)深染棕褐色,主要分布在大腦皮質(zhì)椎體細(xì)胞,海馬顆粒細(xì)胞層,紋狀體 ,膠質(zhì)細(xì)胞,神經(jīng)原,血管內(nèi)皮細(xì)胞。EP組MM P-9陽性細(xì)胞數(shù)較 HIBD組減少,但仍高于對照組 (表1)。

表1 各組 MM P-9陽性細(xì)胞數(shù)(±s,n=6)

表1 各組 MM P-9陽性細(xì)胞數(shù)(±s,n=6)

@與假手術(shù)組比較,P＜0.01,* 與 HIBD組比較,P ＜0.05。

處理時間(h) 陰性對照 HIBD組 EP組62.05± 0.1010.10± 2.49@ 7.50± 2.04@*242.00± 0.1928.75± 2.29@ 14.50± 3.83@*482.05± 0.1026.70± 2.85@ 11.85± 2.56@*722.01± 0.1218.05± 2.35@ 11.75± 3.81@*1202.05± 0.1016.05± 3.25@ 9.70± 2.18@*

3 討論

血腦屏障破壞引起的血管源性腦水腫[6]是缺血缺氧性腦損傷常見的病理過程,嚴(yán)重時形成腦疝導(dǎo)致死亡?；な茄X屏障的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),主要由Ⅳ型膠原、層連蛋白、內(nèi)肌動蛋白、纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白組成。MM P-9能夠切割細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)組分,降解血腦屏障的基本結(jié)構(gòu)基膜,與血腦屏障的損傷導(dǎo)致血管源性腦水腫關(guān)系密切。近年來研究發(fā)現(xiàn),體外血腦屏障缺氧缺血[7]及大鼠腦缺血再灌注[8]均可導(dǎo)致 MM P-9表達(dá)增加。而 MM P-9基因敲除小鼠局部腦缺血后 BBB的損傷明顯低于野生型小鼠[9]。本實驗通過結(jié)扎7日齡新生鼠左側(cè)頸總動脈及缺氧處理后,免疫組化法檢測 MM P-9的表達(dá),結(jié)果6h MM P-9陽性細(xì)胞數(shù)增多,24～ 48h最多,3d減少。與以上實驗基本一致。因此,MM P-9可能是治療缺血缺氧性腦病的一個靶點。體內(nèi)MM P-9的活性受到多個水平的調(diào)節(jié),其中內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑與 MMP-9處于動態(tài)平衡維持正常生理功能。但由于 MM Ps具有高度保守的同源序列其特異性抑制劑人工重組很困難,目前人工合成的 MM Ps抑制劑因存在特異性低,毒副作用大應(yīng)用受到限制。EP是一種安全、穩(wěn)定的脂溶性丙酮酸酯化物,以往研究表明其具有很強的抗炎抗氧化作用。本實驗研究發(fā)現(xiàn) HIBD組腦細(xì)胞腫脹排列紊亂,部分核固縮裂解,可見壞死灶及點狀出血。免疫組化法 MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)強陽性表達(dá),而腹腔注射丙酮酸乙酯后腦細(xì)胞水腫較對 HIBD組減輕未見壞死灶,MMP-9陽性細(xì)胞數(shù)較HIBD組減少,提示丙酮酸乙酯可以降低 MM P-9表達(dá),減輕腦損傷,為臨床治療提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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