周防震 黃敏 張曉元 郭勇

(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510006;2.廣州軍區(qū)機(jī)關(guān)門(mén)診部，廣東廣州510080;3.華南理工大學(xué)工業(yè)技術(shù)研究總院，廣東廣州510640)

惡性腫瘤患者大多數(shù)均需進(jìn)行化療，但化療藥物在殺傷或殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)體內(nèi)正常的組織細(xì)胞也具有明顯的損傷作用.機(jī)體過(guò)量產(chǎn)生的活性氧被認(rèn)為是化療藥物毒副作用的根源［1-3］.文獻(xiàn)資料顯示聯(lián)合化療藥物和具有抗氧化活性的化學(xué)預(yù)防試劑可以增加化療試劑的抗腫瘤作用，降低化療藥物誘導(dǎo)的毒副作用［4］.

二氫楊梅素(DMY)化學(xué)名為 3，5，7，3＇4＇5＇-六羥基-2，3雙氫黃酮醇，是從藤茶(Ampelopsis grossedentata)等植物莖葉中提取的一種二氫黃酮醇化合物.研究表明DMY具有抗氧化、保肝護(hù)肝、降血糖、增強(qiáng)人體免疫力等多種生理活性［5］.阿霉素(ADM)作為一種周期非特異性廣譜抗癌藥物，對(duì)多種腫瘤有明顯療效，已廣泛應(yīng)用到乳腺癌的臨床化療中，但其與劑量依賴性相關(guān)的心肌毒性、骨髓抑制和肝毒性等副作用限制了它的臨床使用［6-7］.前期實(shí)驗(yàn)表明，離體條件下DMY能增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，表現(xiàn)出一定的協(xié)同增效作用［8］，但關(guān)于其在腫瘤化療中的增效減毒作用未見(jiàn)報(bào)道.文中通過(guò)建立4T1乳腺癌細(xì)胞Balb/C小鼠體內(nèi)移植腫瘤模型，探討DMY與ADM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的體內(nèi)抗腫瘤作用，以期為DMY作為化療輔助藥物的開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物和瘤株

SPF級(jí)Balb/C小鼠36只，雌性，體重13～15g，購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)為0076054.實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周.飼料和墊料均購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.實(shí)驗(yàn)期間自由采食飲水.小鼠乳腺癌4T1瘤株由暨南大學(xué)生物工程研究所提供.

1.1.2 藥物

DMY從藤茶(A.grossedentata)中以水提醇沉和重結(jié)晶方法分離純化，并通過(guò)高效液相色譜、紫外光譜、紅外光譜和質(zhì)譜等檢測(cè)和鑒定，純度為96%.注射用鹽酸阿霉素(ADM)由浙江海正藥業(yè)有限公司生產(chǎn).

1.2 方法

1.2.1 腫瘤模型的建立

參照孫鳳梅［9］的方法建立乳腺癌荷瘤小鼠模型.以胰酶消化方式收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1細(xì)胞，利用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)細(xì)胞，14℃、800r/min離心5min，除去上清液，將細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/μL，小鼠麻醉后，每只小鼠于右后腿皮下注射50μL細(xì)胞懸液.

1.2.2 動(dòng)物分組

接種次日開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù).小鼠隨機(jī)分成4組，每組9只.分組如下:對(duì)照組(生理鹽水溶液處理)、2mg/(kg·d)ADM 組、100mg/(kg·d)DMY 組以及聯(lián)合用藥(100mg/(kg·d)DMY+2 mg/(kg·d)ADM)組.

1.2.3 抑瘤率和肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)的計(jì)算

DMY采用灌胃給藥的方式，每天固定時(shí)間給藥，連續(xù)給藥27 d.ADM采用腹腔注射(ip)，給藥3d、停藥3 d為一個(gè)周期.每天測(cè)量小鼠體重，第5個(gè)周期的第4天取血后處死動(dòng)物.剝離腫瘤并稱重，計(jì)算抑瘤率［10］.解剖取出小鼠肺臟，以冰冷的PBS清洗后，以4%的多聚甲醛固定過(guò)夜，Leika雙目解剖鏡8倍下計(jì)數(shù)小鼠肺臟(共5葉)表面轉(zhuǎn)移群落的數(shù)量.

1.2.4 心肝功能的血清檢測(cè)

眼球采血后離心，取上清.利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 DMY對(duì)小鼠瘤重及抑瘤率的影響

各組實(shí)驗(yàn)鼠給藥27 d后處死，剝離腫瘤，觀察發(fā)現(xiàn)腫瘤呈灰白色，浸潤(rùn)，質(zhì)硬.各藥物均能一定程度抑制瘤體的增長(zhǎng)，單獨(dú)使用2 mg/(kg·d)ADM能顯著減少瘤重(P＜0.05)，100 mg/(kg·d)DMY組小鼠的瘤重相比對(duì)照組無(wú)顯著差異，100mg/(kg·d)DMY與2 mg/(kg·d)ADM聯(lián)合用藥組小鼠瘤重顯著小于對(duì)照組(P＜0.01)，2 mg/(kg·d)ADM、100 mg/(kg· d)DMY、2 mg/(kg· d)ADM+100mg/(kg·d)DMY組的抑瘤率分別為28.44%、11.84%和46.92%(見(jiàn)表1).

2.2 DMY對(duì)小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的影響

藥物干預(yù)下荷瘤小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)如圖1所示.從圖1可以看出:各藥物處理組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)顯著低于對(duì)照組(P＜0.01);2 mg/(kg·d)ADM組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)小于100 mg/(kg·d)DMY組，但無(wú)顯著差異;而100 mg/(kg·d)DMY聯(lián)合2mg/(kg·d)ADM組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)顯著小于2mg/(kg·d)ADM組(P＜0.05).

圖1 藥物干預(yù)下荷瘤小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)Fig.1 Lung metastatic loci in tumor-bearing mice treated with drug intervention

2.3 DMY對(duì)化療荷瘤小鼠心臟毒性的影響

各組實(shí)驗(yàn)鼠給藥27 d后的血清生化分析表明，100mg/(kg·d)DMY組小鼠的LDH水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而2mg/(kg·d)ADM處理能顯著增加血清中LDH的含量(P＜0.01)，100mg/(kg·d)DMY聯(lián)合2 mg/(kg·d)ADM處理能顯著降低ADM誘導(dǎo)的LDH的增加量(P＜0.05)，但相對(duì)于對(duì)照組并無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖2).

圖2 藥物干預(yù)下荷瘤小鼠的血清LDH水平Fig.2 Serum LDH level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

圖3顯示了單獨(dú)使用2 mg/(kg·d)ADM或100mg/(kg·d)DMY處理的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠血清的CK水平雖有變化但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，而二者聯(lián)合使用可以顯著降低血清CK水平(P＜0.05).

圖3 藥物干預(yù)下荷瘤小鼠的血清CK水平Fig.3 Serum CK level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

2.4 DMY對(duì)化療荷瘤小鼠肝毒性的影響

藥物干預(yù)下荷瘤小鼠的血清ALT水平如圖4所示.從圖4中可以看出，單獨(dú)使用2 mg/(kg·d)ADM或100mg/(kg·d)DMY，或者二者聯(lián)合使用時(shí)，荷瘤小鼠血清的ALT水平相對(duì)于對(duì)照組并無(wú)明顯差異，但聯(lián)合使用 2 mg/(kg·d)ADM和100mg/(kg·d)DMY的處理組荷瘤小鼠血清的ALT水平低于單獨(dú)使用2mg/(kg·d)ADM的處理組(P=0.058).

圖4 藥物干預(yù)下荷瘤小鼠的血清ALT水平Fig.4 Serum ALT level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

藥物干預(yù)下荷瘤小鼠的血清AST水平如圖5所示.統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用2 mg/(kg·d)ADM的處理組荷瘤小鼠血清中的AST水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而單獨(dú)使用100 mg/(kg·d)DMY的處理組以及聯(lián)合用藥組荷瘤小鼠血清的AST水平相對(duì)于對(duì)照組無(wú)顯著變化.

圖5 藥物干預(yù)下荷瘤小鼠的血清AST水平Fig.5 Serum AST level in tumor-bearing mice treated with drug intervention

3 討論

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，DMY+ADM聯(lián)合用藥組的小鼠毛色相對(duì)于單獨(dú)ADM組更具光澤，且ADM停藥期，聯(lián)合用藥組的小鼠進(jìn)食情況明顯優(yōu)于單獨(dú)ADM用藥組.由于血清中LDH、CK和ALT、AST水平分別是反應(yīng)心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DMY能減輕ADM引起的心肝毒性，對(duì)小鼠心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用.蘇東林等［11］的研究也發(fā)現(xiàn)DMY對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)作用，但DMY對(duì)ADM引起的心臟毒性的保護(hù)作用尚屬首次報(bào)道.

ADM是細(xì)胞周期非特異性藥物，主要通過(guò)將腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M期而發(fā)揮其直接殺傷作用［12］.作用機(jī)理不同的藥物聯(lián)合使用可能通過(guò)互補(bǔ)作用增強(qiáng)了抗腫瘤效果［13］，DMY對(duì)ADM的增效作用可能與DMY的抗腫瘤機(jī)制有關(guān).DMY具有很強(qiáng)的抗氧化作用［14-15］，研究中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組小鼠的脾臟指數(shù)大于單獨(dú)ADM用藥組，表明DMY減輕ADM心肝毒性的機(jī)制可能與其抗氧化作用有關(guān).鄭宏強(qiáng)、劉德育等［16-17］的研究也發(fā)現(xiàn)濃度小于100 μmol/L的DMY(相當(dāng)于32mg/L)不僅對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞不產(chǎn)生毒性作用，還能明顯抑制B16細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)和粘附.由本研究可以看出，與對(duì)照組相比，100mg/(kg·d)DMY能顯著減少荷瘤小鼠腫瘤肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)和瘤重，暗示抑制腫瘤轉(zhuǎn)移可能是DMY的主要抗腫瘤作用機(jī)制.

4 結(jié)語(yǔ)

文中探討了DMY對(duì)乳腺癌荷瘤小鼠化療的增效減毒作用，結(jié)果顯示，100mg/(kg·d)DMY聯(lián)合2mg/(kg·d)ADM處理能明顯提高ADM對(duì)Balb/C小鼠乳腺癌移植瘤的抑瘤率，減少腫瘤肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)，從而顯著增加ADM化療的抗腫瘤效果.血清生化分析顯示DMY與ADM聯(lián)合使用可減少ADM單獨(dú)使用所造成的血清LDH、ALT和AST水平的增加量，表明DMY能降低ADM引起的心、肝毒性反應(yīng).DMY對(duì)荷瘤小鼠ADM化療的增效和減毒作用拓展了DMY的新應(yīng)用，為將其開(kāi)發(fā)為化療藥物的輔助藥物提供了參考，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究.

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