李輝 付時雨 彭林才 詹懷宇

(華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州510640)

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，能夠催化氧化酚類和芳胺類化合物［1］，在廢水處理、芳香族化合物轉化、食品加工、生物醫(yī)藥及生物傳感器構建方面具有重要應用價值［2］.但是，由于游離漆酶在使用過程中易變性失活，且不易從反應體系中分離出來重復使用，這在一定程度上限制了漆酶的工業(yè)化應用.酶固定化是使酶得到更廣泛利用的一個重要手段，固定化的漆酶在利用率、穩(wěn)定性等方面都較游離漆酶有所提高，可為生物傳感器的制備提供良好的條件.在生物傳感器的制備過程中，酶的固定是一個極為重要的環(huán)節(jié)，酶的固定方法影響酶的活力和傳感器的穩(wěn)定性.目前，用于漆酶固定化的傳統(tǒng)方法主要有物理吸附、包埋和共價交聯［3］.然而，這些固定化方法都存在一些不足:物理吸附法作用力較弱，酶負載量較低，且吸附的酶較易脫落;包埋法中，大多數酶包埋在較厚的聚合物膜中，增大了傳感器的響應時間;共價交聯法固定化條件苛刻，可能造成酶的失活，且不易控制酶固定化膜的結構.

靜電層層自組裝是通過交替吸附帶相反電荷的聚電解質在固體基底上構建有序多層膜的一種固定化方法［4］.該方法操作簡單、條件溫和，特別適合制備具有生物活力的薄膜.隨著研究的不斷深入，自組裝材料也逐漸從聚電解質擴展到生物大分子(酶、DNA、蛋白質等)［5-7］、無機納米顆粒［8］、染料［9］等功能性物質.通過層層自組裝技術制備的生物大分子自組裝膜，具有結構高度有序、酶負載量可控等特性，在構筑生物傳感器、生物芯片等領域具有重要意義.目前，國內外關于葡萄糖氧化酶［5，10］、辣根過氧化物酶［11］、過氧化氫酶［12］通過層層自組裝技術構建酶多層膜的研究較多，但應用漆酶構建層層自組裝膜的研究報道較少.Xing等［13］利用靜電層層自組裝的方法成功地在纖維素纖維表面構筑了漆酶自組裝膜，這種方法可以用來制備纖維素纖維基的生物復合材料，Deng、Balkenhoh 和 Szamlcki等［14-16］分別利用層層自組裝的方法將漆酶修飾在電極表面，可用做生物燃料電池的陰極.

在保持酶生物活性不變的前提下，將漆酶高度有序、穩(wěn)定地固定在固體基底上是制備高效漆酶生物傳感器的關鍵一步［17］.文中采用靜電層層自組裝的方法在云母片基底上構筑漆酶自組裝多層膜，利用紫外可見吸收光譜(UV-Vis)、原子力顯微鏡(AFM)追蹤了漆酶自組裝膜的增長及活力變化情況以及自組裝膜的形貌特性，并對利用自組裝方法固定化漆酶的酶學性質進行了研究，以期為漆酶層層自組裝多層膜在生物傳感器中的應用奠定基礎.

1 實驗材料和方法

1.1 材料

漆酶，由筆者所在實驗室自行分離純化得到的一株白腐菌所產粗酶液，經分離純化后得到.純化后漆酶液體為無色，酶活力為20 U/mL，分子質量為62ku;陽離子聚丙烯酰胺(CPAM)，購自廣州市拓羽化工有限公司，分子質量為100 ku;2，2＇-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)，購自Sigma公司;云母片(Mica)，購自美國Veeco公司，并裁成1cm×1cm的規(guī)格.

1.2 方法

1.2.1 層層自組裝

采用典型的靜電層層自組裝步驟，如圖1所示.

圖1 靜電層層自組裝制備CPAM/Laccase自組裝膜示意圖Fig.1 Schematic diagram of the electrostatic LBL self-assembly of CPAM and laccase on mica surface

制備方法參考文獻［1］:將新鮮解離的云母片交替浸入2 g/L的 CPAM溶液、漆酶液體中各20min，每次后用超純水徹底漂洗，然后取出用冷風吹干，如此重復上述操作步驟，即可制備理想層數的CPAM/Laccase多層自組裝膜.

1.2.2 酶活力的測定

游離漆酶活力測定:1.6 mL 0.5 mmol/L ABTS溶液中加入1.6mL經適當稀釋的酶液，在一定溫度下，用Agilent-8453型紫外可見分光光度計測定該反應體系在3min內420 nm處的吸光度的變化，計算反應初速度.

自組裝固定化漆酶活力測定:1.6mL 0.5mmol/L ABTS溶液中加入1.6mL HAc-NaAc緩沖液，然后放入負載有CPAM/Laccase自組裝膜的云母片，在一定溫度下，用Agilent-8453型紫外可見分光光度計測定該反應體系在3 min內420 nm處吸光度的變化，計算反應初速度.ABTS的摩爾吸光系數 ε=3.6 ×104L/(mol· cm)，以每分鐘氧化 1 μmol ABTS的酶量定義為一個酶活單位.

1.2.3 AFM分析

使用Veeco公司生產的Multimode Nanoscope III a原子力顯微鏡，以輕敲模式在空氣中對樣品進行掃描，圖像分辨率為512×512，掃描圖像尺寸為1μm×1μm.利用Version5.12 r3軟件在線記錄圖像，利用WSxM軟件對圖片進行離線分析，每個樣品選擇5個不同的位置進行掃描，選擇具有重復特征的圖片進行分析.

2 結果與討論

2.1 CPAM/Laccase自組裝膜的增長

利用UV-Vis吸收光譜追蹤CPAM/Laccase自組裝膜活力增長情況，如圖2所示.以酶促反應的初速度來衡量CPAM/Laccase自組裝膜活力的大小.

由圖2可見，當云母片表面通過靜電沉積過程形成CPAM/Laccase自組裝膜后，膜的活力隨著組裝層數的增加呈線性增長，這表明ABTS小分子可滲透進入CPAM/Laccase膜與內層已組裝的漆酶發(fā)生反應，并且每一層吸附的漆酶量基本相同.利用靜電層層自組裝固定漆酶的過程中，僅僅依靠靜電相互作用力，漆酶的結構基本沒有變化，而且組裝過程條件溫和，不存在使酶失活的不利因素，同時在自組裝膜中，漆酶分子得到充分的鋪展，有利于漆酶活力位點的充分暴露.因此，通過靜電層層自組裝的方法對漆酶進行固定化，可通過調節(jié)自組裝的層數實現可控的酶負載量.

利用船、車等工具對羊進行長距離的運輸，或者羊的營養(yǎng)狀況較差，均會致使其機體防御功能大幅度下降，進而對其腸胃的防御機制造成影響，致使正常情況下胃腸中存在但不會導致羊患病的一些病菌，例如大腸桿菌以及壞死桿菌等的毒性大幅度提升，最終使得羊患病。

圖2 CPAM/Laccase自組裝膜催化ABTS反應活力隨膜層數的變化Fig.2 Catalytic activity of LBL of CPAM/laccase self-assembled films towards ABTS with the number of layers

2.2 固定化漆酶的表面形貌

為了觀察漆酶在CPAM/Laccase自組裝膜中的形貌，利用輕敲模式的AFM對不同層數的自組裝膜進行掃描.云母片及單層陽離子聚電解質CPAM自組裝膜的AFM-3D圖如圖3所示.

圖3 云母片和單層CPAM自組裝膜的AFM-3D圖Fig.3 AFM 3D images of Mica and CPAM self-assembled monolayer film

由圖3可見，新鮮解離的云母片表面平整均勻，通過WSxM計算出其均方根(RMS)粗糙度僅為0.0632nm，平均高度為0.0381nm.單層CPAM自組裝膜表面也較為平整均勻，RMS粗糙度為0.114nm，平均高度為0.7814nm.

不同層數CPAM/Laccase自組裝膜的AFM高度圖及其對應的3D圖如圖4所示.單層CPAM/Laccase自組裝膜表面呈現出均勻分布的粒狀物質(圖4(a))，與云母片及單層聚電解質CPAM自組裝膜表面形貌完全不同，并且粒狀物質的覆蓋率為98%.Mazur等［18］利用 AFM 觀察到漆酶在鋯磷酸鹽改性的金表面沉積形成的單層膜中呈現出粒狀形態(tài)，顆粒尺寸約在15～150 nm范圍內(單個漆酶分子的結晶尺寸約為5 nm［19］)，是單個漆酶分子和漆酶分子的聚集.本研究中觀察到的顆粒尺寸約在10～60nm范圍內，因此推斷這些顆粒狀物質為單個漆酶分子和漆酶分子的聚集，同時從自組裝膜的AFM-3D圖中，可以發(fā)現漆酶分子的分布是比較清晰均勻的，聚集團聚的現象較少.隨著組裝層數的增加，粒狀漆酶分子在自組裝膜中的覆蓋率逐漸增加(見圖4(c)和(e))，3層 CPAM/Laccase自組裝膜表面漆酶分子分布更加均勻致密，覆蓋率達到100%.

圖4 不同層數的CPAM/Laccase自組裝膜的AFM形貌圖及3D圖Fig.4 AFM topography and 3D images of CPAM/Laccase selfassembled films with different number of layers

自組裝膜高度的增長情況是表征自組裝過程進行的重要參數，而自組裝膜表面RMS粗糙度是表征酶分子形貌的重要參數，因此，為了考察自組裝過程中膜的增長情況及觀察評估自組裝膜中漆酶分子形貌，利用WSxM對自組裝膜進行分析，結果見表1.隨著自組裝的進行，CPAM/Laccase自組裝膜的平均高度和RMS粗糙度逐漸增大，與HRP層層自組裝膜的RMS粗糙度增長趨勢相一致［20］.

表1 不同層數的CPAM/Laccase自組裝膜的平均高度及RMS粗糙度Table 1 Average height and RMS roughness of CPAM/Laccase self-assembled films with different number of layers

2.3 固定化漆酶的酶學性質

以3層CPAM/Laccase自組裝膜為研究對象，對層層自組裝固定化漆酶的酶學性質進行研究，并與游離漆酶進行比較.

2.3.1 最適pH值和溫度

pH值和溫度對游離漆酶和固定化漆酶活力的影響如圖5所示.由圖5(a)可見，固定化漆酶和游離漆酶的最適pH值均為5.0，這是因為自組裝過程條件溫和，固定化漆酶基本上保持了游離漆酶的特性，所以pH值對固定化漆酶活力影響不大.由圖5(b)可見，固定化漆酶的最適反應溫度為50℃，較游離漆酶的45℃上升了5℃，這說明固定化之后漆酶的耐熱性能得到了提高.

2.3.2 固定化漆酶的熱穩(wěn)定性

圖5 pH值和溫度對漆酶活力的影響Fig.5 Effect of pH value and temperature on laccase activity

在相同的保溫時間(6h)下，游離漆酶和固定化漆酶的剩余活力隨溫度的變化見圖6.隨著溫度的升高，游離漆酶和固定化漆酶剩余活力之差增大，在40℃時，游離漆酶幾乎完全失活，而固定化漆酶在此溫度下仍然保持在同組最高活力的60%左右.

圖6 相同保溫時間下漆酶剩余活力隨溫度的變化Fig.6 Changes of the residual activity of laccase with temperature at the same soaking time

在相同的保溫溫度(50℃)條件下，游離漆酶和固定化漆酶的剩余活力隨保溫時間的變化規(guī)律如圖7所示.游離漆酶在50℃保溫30min后，其活力下降很明顯，180min后，剩余活力僅為最初的10%，而固定化漆酶在50℃保溫，其活力下降緩慢，180 min后，活力仍為原來的61%，可見固定化漆酶具有更好的熱穩(wěn)定性.這可能是由于在層層自組裝固定漆酶的過程中，漆酶分子高度有序排列，分子之間的相互作用使得漆酶分子緊密排列，其結構剛性增強，因而抗拒熱變性作用能力增強，游離漆酶由于缺乏這些作用，所以較易變性失活［21］.

圖7 50℃下漆酶剩余活力隨保溫時間的變化Fig.7 Changes of the residual activity of laccase with the incubation time at 50℃

2.3.3 酶催化反應動力學

在不同ABTS濃度下分別測定游離漆酶和固定化漆酶的活力，求出反應初速度 v，用 Linweaver-Burk雙倒數作圖法作圖，得到反應初速度v與ABTS濃度間的關系曲線，如圖8所示，根據圖示結果求出游離漆酶和固定化漆酶的米氏常數Km值分別為0.014和0.042mmol/L.Km變大說明固定化后，漆酶對底物的親和力有所降低，這可能是由于底物ABTS向內層吸附的漆酶滲透擴散的過程中，內層漆酶附近的底物ABTS濃度要比溶液中的低，導致底物ABTS與漆酶接觸的幾率變小，親和力降低.

圖8 游離漆酶和固定化漆酶的米氏常數Fig.8 Michaeils constant of free and immobilized laccase

2.3.4 可重復使用性和存儲穩(wěn)定性

將負載有3層CPAM/Laccase自組裝膜的云母片置于比色皿中，根據1.2.2中方法測定吸光度的變化，計算出酶促反應初速度;然后分離出云母片，用純水洗3次，重新與新鮮的反應液進行反應，再次計算出酶促反應初速度;如此多次操作，測定固定化漆酶的可重復使用性，結果如圖9(a)所示.在前3次重復使用過程中，酶活力損失較大，重復了3次后，剩余酶活力為初始酶活力的61%.然而，隨著重復使用次數的增加，酶活力的變化趨于平穩(wěn)，重復使用6次后，剩余酶活力約為初始酶活力的49%，相比重復使用4次僅降低了3個百分點.

將負載有3層CPAM/Laccase自組裝膜的云母片在4℃下放置1、2、3、4周，分別測定其酶促反應初速度，考察固定化漆酶的存儲穩(wěn)定性，結果如圖9(b)所示.存儲1周后，固定化漆酶剩余酶活力為初始酶活力的63%，損失較大;從第2周開始，固定化漆酶的活力進入了一個相對穩(wěn)定的階段，存儲4周后，剩余酶活力為初始酶活力的48%，相比儲存2周的酶活僅降低了4個百分點.大量研究也發(fā)現，依靠靜電相互作用的固定化酶在存儲的初始階段會發(fā)生明顯脫附現象［13，22-24］，導致酶活力損失較為嚴重，這被認為是靜電相互作用固定化酶普遍存在的現象，然而在隨后較長時間內，酶活力則能保持相對穩(wěn)定.本研究的結果表明，在至少一個月的時間內，固定化漆酶活力能夠維持在一個較佳的水平，具有良好的存儲穩(wěn)定性.

圖9 固定化漆酶的可重復使用性和存儲穩(wěn)定性Fig.9 Reusability and storage stability of immobilized laccase

3 結論

(1)CPAM/Laccase自組裝膜的活力隨自組裝層數的增加呈線性增長，可通過控制自組裝的層數實現可控的酶負載量;

(2)漆酶在自組裝膜中以顆粒狀的形式均勻分布，自組裝膜的平均高度及均方根粗糙度隨著自組裝層數的增大逐漸增大;

(3)相對于游離態(tài)漆酶，固定化漆酶的最適pH值沒有改變，最適溫度從游離態(tài)的45℃上升至50℃，固定化漆酶的米氏常數為0.042 mmol/L，固定化漆酶熱穩(wěn)定性明顯提高;

(4)層層自組裝方法固定化的漆酶在使用一定次數或儲存一段時間后，漆酶活力將會處于一個相對平穩(wěn)的階段，具有良好的可重復使用性和存儲穩(wěn)定性.

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