傅愷 付時(shí)雨 張麗 周攀登 詹懷宇

(華南理工大學(xué)制漿造紙工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)

纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是地球上最豐富的可再生三大有機(jī)資源，統(tǒng)稱為木質(zhì)纖維素.自然界中參與木質(zhì)纖維素降解的微生物主要有真菌、細(xì)菌和放線菌，但是很多微生物都沒(méi)有獨(dú)立降解木質(zhì)纖維素——特別是木質(zhì)素的能力，而木腐真菌則能夠通過(guò)其分泌的生物酶進(jìn)攻纖維細(xì)胞壁，造成木質(zhì)纖維素的降解，表現(xiàn)為木質(zhì)腐朽.白腐菌是對(duì)木質(zhì)素降解能力最強(qiáng)的木腐真菌之一，是目前已知的能在一定條件下將木質(zhì)素徹底降解為CO2和H2O的唯一一類生物，其分泌的木質(zhì)素降解酶主要有木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶和漆酶［1］.

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，底物范圍非常廣泛，能夠催化氧化多種酚類和芳胺類化合物.在某些小分子介體存在的條件下，漆酶還能夠氧化非酚型木質(zhì)素，此過(guò)程中，介體在漆酶的作用下會(huì)形成活性較高且有一定穩(wěn)定性的中間體，這些活性中間體能從氧分子中獲得電子傳遞給底物，從而使底物降解.相對(duì)于酶，介體形成的中間體體積較小，易擴(kuò)散，可以達(dá)到酶蛋白所不能進(jìn)入的區(qū)域，從而擴(kuò)大了漆酶催化反應(yīng)的作用范圍［2］.近十幾年來(lái)，漆酶對(duì)木質(zhì)素和與木質(zhì)素結(jié)構(gòu)相似的許多環(huán)境污染物的降解作用越來(lái)越受到科研工作者的關(guān)注，特別是在紙漿生物漂白［3］、工業(yè)廢水處理［4］、有機(jī)染料脫色［5］和高分子催化合成［6］等方面，表現(xiàn)出了很大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力.

隨著檢測(cè)分析技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外的研究者通過(guò)多種生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，對(duì)漆酶有了更深入的研究和了解，主要集中在蛋白分子質(zhì)量、多糖含量、等電點(diǎn)、催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)、最適反應(yīng)溫度和pH值、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和底物特異性等方面［7-12］.總體而言，真菌漆酶在蛋白結(jié)構(gòu)方面具有諸多的共性，但是來(lái)源于不同菌種的漆酶之間，以及來(lái)源于同一菌種的漆酶同工酶之間也存在著不同程度的差異，必須掌握它們特定的酶學(xué)性質(zhì)才能夠提供正確的反應(yīng)條件以發(fā)揮漆酶的催化作用.然而微生物的發(fā)酵液通常都是以復(fù)雜的混合物形式存在，含有很多分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)和功能等都不同的無(wú)機(jī)鹽、多糖和蛋白質(zhì)等，不利于對(duì)漆酶的深入精確研究，因此采用高效率、高得率的分離純化方法，從真菌發(fā)酵液中獲得高純度、高活性和完整的漆酶蛋白，成為研究漆酶結(jié)構(gòu)、功能以及酶學(xué)性質(zhì)的前提.

P.candolleana隸屬于真菌門(mén)，擔(dān)子菌亞門(mén)，傘菌目，鬼傘科，脆柄菇屬，是中國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)的一種可食用型真菌，野生量較大，但是目前為止國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)關(guān)于其生產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶，特別是漆酶的研究和報(bào)道.筆者所在實(shí)驗(yàn)室從采集的多株野生木腐菌子實(shí)體或菌絲樣品中，分離篩選出一株產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)的菌株，在自然環(huán)境下能夠使植物的木質(zhì)部分發(fā)生白腐現(xiàn)象，故也稱白腐菌，經(jīng)18s rDNA序列分析鑒定為P.candolleana.該野生菌種經(jīng)人工紫外線誘變選育和優(yōu)化培養(yǎng)后，搖瓶發(fā)酵的漆酶產(chǎn)量大幅提高，具有較高的深入研究的價(jià)值和應(yīng)用潛力［13-14］.文中將 P.candolleana漆酶的生產(chǎn)擴(kuò)大到發(fā)酵罐規(guī)模(5 L)，對(duì)其所產(chǎn)漆酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)該漆酶的部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種:P.candolleana野生菌株經(jīng)筆者所在實(shí)驗(yàn)室紫外誘變選育后，4℃下保存于PDA培養(yǎng)基中.

種子培養(yǎng)基:1L馬鈴薯浸出液中加入無(wú)水葡萄糖 20g，蛋白胨 1g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O 3g.

發(fā)酵培養(yǎng)基:1L種子培養(yǎng)基中再加入麥麩10g，消泡劑0.2mL，CuSO4·5H2O 2mmol.

主要設(shè)備和儀器:SHKE5000恒溫?fù)u床，Thermo公司生產(chǎn);BioFlo 110型5 L機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐系統(tǒng)，NBS公司生產(chǎn);3K15冷凍離心機(jī)，Sigma公司生產(chǎn);8453紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Agilent公司生產(chǎn);Pellicon超濾系統(tǒng)，Millipore公司生產(chǎn);AKTA自動(dòng)層析系統(tǒng)，GE公司生產(chǎn);垂直電泳儀，BIO-RAD公司生產(chǎn).

1.2 方法

1.2.1 白腐菌液體深層發(fā)酵

供試P.candolleana菌種由PDA斜面轉(zhuǎn)接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，150r/min、28℃震蕩培養(yǎng)3 d后，菌絲體經(jīng)過(guò)濾、洗滌后打散，收集于無(wú)菌水中制成菌絲懸浮液，將500mL菌絲懸浮液于無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接入裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，葉輪轉(zhuǎn)速300 r/min，培養(yǎng)液溫度通過(guò)循環(huán)冷凝水維持在28℃，同時(shí)向發(fā)酵罐中通入氧氣以維持發(fā)酵液的溶氧度.定時(shí)抽取發(fā)酵液用于測(cè)定葡萄糖濃度和漆酶活力，并記錄pH值的變化情況.發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)紗布過(guò)濾除去菌絲體和麥麩殘?jiān)?℃下5000r/min冷凍離心15min，收集上清液即得粗酶液.

1.2.2 漆酶的分離純化步驟

在100mL粗酶液中加入17.4g(NH4)2SO4(使(NH4)2SO4在粗酶液中的飽和度達(dá)到硫酸銨總飽和度的30%)，4℃靜置2 h，冷凍離心后收集上清液，再加入35.6 g(NH4)2SO4(使(NH4)2SO4在粗酶液中的飽和度達(dá)到硫酸銨總飽和度的80%)，4℃靜置4h，冷凍離心后收集沉淀備用.固體粗酶用去離子水充分溶解，轉(zhuǎn)入Pellicon切向流超濾系統(tǒng)中，超濾膜阻留分子質(zhì)量為10 ku，超濾至酶液中無(wú)離子存在.將充分溶脹和酸堿預(yù)處理后的DE52纖維素離子交換劑裝入層析柱(1.5 cm×70cm)，以0.05 mol/L、pH4.8的醋酸緩沖液(緩沖液A)充分平衡色譜柱.酶液上樣體積30mL，用0～1.0mol/L NaCl溶液(以緩沖液A為溶劑配制)梯度洗脫，洗脫時(shí)間8h，全程恒流速度1mL/min，分部收集過(guò)柱分離液(5 mL/管).檢測(cè)分離液的漆酶活力，將有酶活的部分合并，轉(zhuǎn)入超濾系統(tǒng)中，超濾至酶液中無(wú)Cl-離子存在.

1.2.3 漆酶活力測(cè)定

用等體積 0.5 mmol/L 2，2＇-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)溶液和適當(dāng)稀釋的酶液反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)過(guò)程的前3 min內(nèi)420 nm處吸光度的變化量，定義每分鐘使1 μmol ABTS轉(zhuǎn)化所需要的酶量為1個(gè)漆酶活力單位(U).

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

酶液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法［15］.

1.2.5 SDS-PAGE分析

采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)測(cè)定漆酶蛋白分子量，濃縮膠和分離膠濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為5%和12%，以低分子質(zhì)量蛋白Marker為標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)束后膠板用考馬斯亮藍(lán)R-250染色.

1.2.6 漆酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定

在常溫下，將漆酶分別與不同濃度的ABTS溶液反應(yīng)，記錄反應(yīng)過(guò)程的前3 min內(nèi)反應(yīng)體系在420nm處吸光度的變化，通過(guò) Michaelis-Menten方程，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算漆酶對(duì)底物ABTS的米氏常數(shù)Km.

1.2.7 pH值對(duì)漆酶活力和穩(wěn)定性的影響

分別在不同酸堿條件下測(cè)定漆酶的活力，設(shè)最高者的相對(duì)酶活為100%.為考察漆酶的酸堿穩(wěn)定性，將漆酶于4℃下分別保存于不同pH值的緩沖液中(pH值在3.0～7.0之間的醋酸緩沖液)，定時(shí)測(cè)定其剩余活力，設(shè)定原始漆酶的相對(duì)活力為100%.

1.2.8 溫度對(duì)漆酶活力和穩(wěn)定性的影響

分別在不同溫度下測(cè)定漆酶的活力，設(shè)最高者的相對(duì)酶活為100%.為考察漆酶的熱穩(wěn)定性，將漆酶分別保存于不同溫度條件下，定時(shí)測(cè)定其剩余活力，設(shè)定原始漆酶的相對(duì)活力為100%.

1.2.9 金屬離子對(duì)漆酶活力的影響

將漆酶分別用一定濃度的 CuSO4、KCl、NaCl、MnSO4、CaCl2、FeSO4、FeCl3、MgSO4、ZnSO4、BaCl2和AlCl3溶液適當(dāng)稀釋，然后與等體積的0.5 mmol/L的ABTS溶液混合，使反應(yīng)體系中金屬離子的濃度分別達(dá)到1 mmol/L和5 mmol/L，立即測(cè)定漆酶活力，設(shè)定原始純化漆酶的活力為100%.

1.2.10 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理

以上實(shí)驗(yàn)均平行做2個(gè)樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 漆酶的產(chǎn)生

真菌漆酶的生產(chǎn)擴(kuò)大化和規(guī)?；瞧崦笍膶?shí)驗(yàn)室研究走向工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和必由之路，對(duì)提高漆酶產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本以實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化應(yīng)用具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義.本研究將P.candolleana漆酶的生產(chǎn)由搖瓶擴(kuò)大到5L規(guī)模(工作體積3.5L)的發(fā)酵罐中，對(duì)真菌漆酶的初步擴(kuò)大化生產(chǎn)進(jìn)行探索，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.由圖1可見(jiàn)，漆酶在第1天時(shí)即表現(xiàn)出一定的活力，隨后快速升高，至第5天時(shí)酶活升至最大，約9100U/L.發(fā)酵液的pH值始終保持緩慢上升的趨勢(shì)，由原始pH5.3上升至第6天時(shí)的7.1左右.此外，由于氧氣供給充足，發(fā)酵液中溶氧度一直維持在較高水平，因此白腐菌細(xì)胞繁殖很快，菌絲生長(zhǎng)較為旺盛，相應(yīng)的對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)需求量較大，這可能是培養(yǎng)基中葡萄糖消耗速度較快的主要原因.

圖1 P.candolleana漆酶的生產(chǎn)Fig.1 Laccase production from P.candolleana

近幾年國(guó)內(nèi)外報(bào)道的相關(guān)研究結(jié)果表明，P.candolleana在發(fā)酵罐中的漆酶產(chǎn)量較高，并且發(fā)酵周期短，具有較大的研究和應(yīng)用優(yōu)勢(shì)［16-17］.但是相比于筆者所在實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道的搖瓶發(fā)酵研究結(jié)果［13-14］，相同條件下 P.candolleana在發(fā)酵罐中漆酶的單位體積產(chǎn)量還較低，只達(dá)到搖瓶中的50%左右.這主要是因?yàn)榘l(fā)酵罐中存在著與搖瓶發(fā)酵迥異的動(dòng)力、熱量、物料以及氧氣等的傳遞特性，發(fā)酵過(guò)程中各種參數(shù)不易控制，嚴(yán)重影響微生物的生長(zhǎng)和代謝.觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，P.candolleana菌絲體生長(zhǎng)后期發(fā)酵液的黏稠度顯著提高，對(duì)物料、熱量和氧氣的均勻傳遞會(huì)有一定的影響，這可能也是導(dǎo)致漆酶產(chǎn)量低于搖瓶發(fā)酵的原因之一.另外，雖然可以通過(guò)提高攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)促進(jìn)物料的傳遞，但是許多報(bào)道都指出，過(guò)高的轉(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致菌絲受到的剪切力增大，抑制細(xì)胞繁殖代謝和漆酶的分泌，甚至導(dǎo)致細(xì)胞破裂［16］.

2.2 漆酶的分離純化

粗酶液經(jīng)(NH4)2SO4分級(jí)鹽析和離子交換色譜柱分離后，其在280nm處的洗脫曲線共出現(xiàn)兩個(gè)可明顯辨認(rèn)的紫外吸收峰，用ABTS檢測(cè)出只有第一個(gè)洗脫峰附近的分離液具有明顯的漆酶活性.合并此洗脫峰附近的分部收集液，得到P.candolleana純化漆酶，純化結(jié)果如表1所示.純化漆酶的比活力達(dá)438.0U/mg，提高到原始粗酶液的13.2倍，總漆酶活力得率為50.1%.該樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)只顯示出一條蛋白染色譜帶，如圖2所示，表明分離純化得到的漆酶為單一組分蛋白，已達(dá)到電泳純級(jí)別.

表1 P.candolleana漆酶的純化結(jié)果Table 1 Purification of laccase from P.candolleana

2.3 漆酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 漆酶蛋白分子質(zhì)量

真菌漆酶的分子量通常集中在50～80 ku之間［18］，P.candolleana純化漆酶經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)R-250染色后顯示出單條譜帶，以低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為參比(圖2)，根據(jù)分子質(zhì)量與相對(duì)遷移率之間的關(guān)系，求得該漆酶的分子質(zhì)量約為61.2ku，與大多數(shù)真菌漆酶的分子質(zhì)量相近.

圖2 P.candolleana漆酶的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of laccase from P.candolleana

2.3.2 漆酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)

米氏常數(shù)Km是酶的特征常數(shù)之一，能夠反映漆酶對(duì)底物親和力的大小，Km值越小，親和力越大，漆酶對(duì)底物的氧化率也就越高.通過(guò)米氏方程，采用雙倒數(shù)作圖法得到酶促反應(yīng)速度v和底物濃度之間的關(guān)系曲線如圖3所示.由此計(jì)算出P.candolleana漆酶對(duì)底物ABTS的Km為0.016 mmol/L.與已報(bào)道［7-12］的其它來(lái)源的真菌漆酶相比，相同條件下P.candolleana漆酶的米氏常數(shù)較低，表現(xiàn)出了對(duì)底物ABTS更高的親和力，催化反應(yīng)速度較快.何為等［19］認(rèn)為，在紙漿生物漂白過(guò)程中，漆酶/介體系統(tǒng)的介體濃度是不斷下降的，Km值小的漆酶可以在介體濃度降低的條件下，維持較快的介體自由基的形成速度，從而有利于紙漿的脫木素過(guò)程.

圖3 P.candolleana漆酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.3 Linewear-Burk plots of laccase from P.candolleana

2.3.3 漆酶最適反應(yīng)pH值和酸堿穩(wěn)定性

pH值對(duì)P.candolleana漆酶活力的影響如圖4所示.由圖4可見(jiàn)，以ABTS為底物時(shí)，漆酶在酸性條件下活力較高，其中在pH值為5.0時(shí)的活力最高.當(dāng)pH值大于5.5后，酶活下降非常迅速，在pH值為6.0和7.0條件下漆酶酶活分別僅為最高酶活的89.6%和72.2%.

圖4 pH值對(duì)漆酶活力的影響Fig.4 Effect of pH value on laccase activity

將漆酶分別置于不同pH值的緩沖液中，4℃下保存，漆酶活力隨保溫時(shí)間的變化如圖5所示.漆酶的活力隨保溫時(shí)間的增加而降低，酸堿環(huán)境對(duì)其影響較大，在弱堿性條件下時(shí)酶活穩(wěn)定性較好，其中在pH值為9.0的條件下，漆酶活力損失最慢，保存16d后，酶活能夠保持為初始酶活的84.5%.過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境都會(huì)損害漆酶活力的穩(wěn)定性，酶活損失較快，當(dāng)pH值小于6.0或者大于10.0時(shí)，漆酶活力在保存16d后損失即超過(guò)1/4.

圖5 不同pH值下漆酶的穩(wěn)定性Fig.5 Stability of laccase at different pH value

2.3.4 漆酶最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

不同反應(yīng)溫度對(duì)P.candolleana漆酶活力的影響如圖6所示.漆酶在40～50℃時(shí)能保持較高的活力，其中在45℃時(shí)，酶活達(dá)到最高.當(dāng)溫度低于30℃或者高于50℃后，酶活降低很快，在20℃和70℃時(shí)，漆酶酶活分別僅為最高酶活的74.3%和74.1%.

圖6 溫度對(duì)漆酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on laccase activity

不同溫度下，漆酶活力隨保溫時(shí)間的變化如圖7所示.漆酶活力隨保溫時(shí)間的增加而降低，在低溫條件下，漆酶活力損失較慢，在4℃和10℃下保存16d后，漆酶活力分別為初始酶活的84.5%和81.5%;當(dāng)溫度超過(guò)30℃后，酶活損失較快，16d后已基本喪失殆盡;溫度超過(guò)40℃，保存6d后，漆酶活力即完全喪失.這說(shuō)明P.candolleana漆酶的最適保存溫度和最適反應(yīng)溫度相差較大，因此在實(shí)際應(yīng)用中，工作溫度的確定應(yīng)當(dāng)兼顧漆酶最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的要求，可在稍低于漆酶最適反應(yīng)溫度的范圍內(nèi)選擇.

圖7 不同溫度下漆酶的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of laccase at different temperature

2.3.5 常見(jiàn)金屬離子對(duì)漆酶活力的影響

未漂紙漿、有機(jī)廢水等白腐菌漆酶的生物處理環(huán)境中往往含有大量不同種類的金屬離子，都會(huì)在一定程度上影響漆酶的活性，使漆酶的用量和濃度不易控制.以ABTS為底物時(shí)，各金屬離子對(duì)漆酶活力的影響如表 2所示.Mg2+、Mn2+、Zn2+對(duì) P.candolleana漆酶活力的影響很小，分別表現(xiàn)為微弱的激活或抑制作用，酶活基本都保持在100%左右;K+、Na+、Ca2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Fe3+等對(duì)漆酶活力都表現(xiàn)出了比較明顯的抑制作用，特別是離子濃度較高(5mmol/L)時(shí)抑制作用更加明顯;Fe2+對(duì)漆酶活性的抑制作用最為強(qiáng)烈，F(xiàn)e2+濃度為5 mmol/L時(shí)，表現(xiàn)為完全抑制，測(cè)定的酶活幾乎為0.王習(xí)文等［20］對(duì)Fe2+影響漆酶活力的機(jī)理進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，結(jié)果表明，F(xiàn)e2+的抑制作用是暫時(shí)性的，一段時(shí)間后漆酶又能重新恢復(fù)活性，并繼續(xù)進(jìn)行催化反應(yīng)，且反應(yīng)速度與未加入Fe2+時(shí)近似，恢復(fù)所需時(shí)間隨Fe2+濃度的增加而延長(zhǎng).其機(jī)理可能為:Fe2+的抑制位點(diǎn)既不是漆酶本身，也不是底物分子，沒(méi)有改變漆酶和底物的狀態(tài)，也沒(méi)有影響漆酶和底物的結(jié)合速度，但是Fe2+能通過(guò)對(duì)催化反應(yīng)產(chǎn)物ABTS自由基的還原作用，使其恢復(fù)到底物起始狀態(tài)來(lái)延緩漆酶催化氧化反應(yīng)的進(jìn)程，因此，F(xiàn)e2+抑制漆酶催化活性的有效位點(diǎn)是催化反應(yīng)的產(chǎn)物ABTS自由基.

表2 金屬離子對(duì)漆酶活性的影響Table 2 Effect of metal ions on laccase activity

3 結(jié)論

(1)P.candolleana經(jīng)人工誘變選育后，其發(fā)酵罐培養(yǎng)的漆酶產(chǎn)量最高可達(dá)9100U/L.

(2)分離純化發(fā)酵液后得到的P.candolleana漆酶，比活力達(dá)到438.0U/mg.

(3)SDS-PAGE電泳檢測(cè)顯示出單條蛋白染色譜帶，漆酶蛋白分子質(zhì)量約為61.2ku.

(4)通過(guò)對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的分析表明，該漆酶表現(xiàn)出較為典型的真菌漆酶特征，其米氏常數(shù)為0.016mmol/L，催化反應(yīng)最適溫度和pH值分別為45℃和5.0，漆酶活性在4～10℃和pH9.0條件下具有較好的穩(wěn)定性，Mg2+、Mn2+、Zn2+等金屬離子對(duì)其活力的影響較小.

(5)和文獻(xiàn)報(bào)道的多種漆酶相比，P.candolleana漆酶底物親和力較強(qiáng)，在紙漿生物漂白、有機(jī)染料脫色和廢水處理等工業(yè)污染控制領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用潛力和價(jià)值.

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