蘇振宏 王 芳 尹美珍

(黃石理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北黃石435003)

0 引言

發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme Born.et Flash.)是一種具有異型胞經(jīng)濟(jì)型固氮藍(lán)藻，俗名頭發(fā)菜、地毛、發(fā)菜等，分類系統(tǒng)中屬于原核生物界(Procaryotae)，藍(lán)藻門(Cyanophta)，藍(lán)藻綱(Cyanophceae)，念珠藻屬(Nostoc)。在我國主要分布于北部和西北部荒漠、半荒漠地區(qū)，能進(jìn)行光合作用和固氮作用，是荒漠土壤中有機(jī)氮和碳的重要來源之一，具有重要的生態(tài)學(xué)作用。隨著市場對發(fā)狀念珠藻的需求逐漸增加，人們大面積的采集，亂揀亂摟，已造成該資源漸趨枯竭，導(dǎo)致草場退化和沙化，嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境，影響了農(nóng)牧民的正常生產(chǎn)和生活，在一些地方還影響到民族團(tuán)結(jié)和社會(huì)穩(wěn)定，如何解決這個(gè)難題是藻類學(xué)家的當(dāng)務(wù)之急[1，8]。依據(jù) 2000 年《中華人民共和國野生植物保護(hù)條例》的有關(guān)規(guī)定，將發(fā)菜的保護(hù)級別由目前的二級調(diào)整為一級。長期以來人們一直試圖采用人工培養(yǎng)的方法增加其生物量，以滿足日益增長的市場需求，而目前發(fā)狀念珠藻人工培養(yǎng)又尚未取得理想進(jìn)展[2，8]。筆者從天然發(fā)狀念珠藻原植體中分離純化細(xì)胞，并對其液體懸浮培養(yǎng)生長特性進(jìn)行了相關(guān)研究，旨在為解決野生發(fā)狀念珠藻資源日趨減少而減輕采集野生發(fā)菜而產(chǎn)生的環(huán)境壓力，為野生發(fā)狀念珠藻大規(guī)模人工培養(yǎng)提供科學(xué)參考。

1 材料

1.1 試劑和儀器

植物光照生長箱、玻璃勻漿器、細(xì)菌過濾器、三角瓶、全自動(dòng)高壓滅菌鍋、分光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)。BG11培養(yǎng)基組成(1 000 mL)如表1所示(BG110就是 BG11培養(yǎng)基不加NaNO3)。

表1 BG11培養(yǎng)基配方

1.2 材料

發(fā)狀念珠藻采集于甘肅省隴西縣，實(shí)驗(yàn)時(shí)已在室溫干燥保存半年。實(shí)驗(yàn)前取少許除去表面塵埃和雜物，再用無菌BG-11清洗至少6次。70%的酒精消毒5～10 min，然后在溫度 25 ℃ ，光照 40 μmol·m-2·s-1的條件下用已滅菌BG-11培養(yǎng)液浸潤4～6 h至不再吸水膨脹后備用[3]。

2 方法

2.1 發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的分離純化

利用勻漿器研磨清洗準(zhǔn)備好的發(fā)狀念珠藻材料，由于勻漿機(jī)械作用，可產(chǎn)生大量藻絲體和游離單細(xì)胞，然后稀釋成不同濃度接種于BG110固體培養(yǎng)基上，挑選單藻落單培養(yǎng)。經(jīng)鏡檢確定為無雜藻雜菌純發(fā)狀念珠藻培養(yǎng)物后，一部分保種保存培養(yǎng)于BG11固體培養(yǎng)基上，另一部分培養(yǎng)在50 mL BG11液體培養(yǎng)基中[3]。

2.2 發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的培養(yǎng)

2.2.1 藻種培養(yǎng)

將發(fā)狀念珠藻分別接種到固體BG11(保種)和液體BG11培養(yǎng)基。置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。溫度控制在25±1℃，光照強(qiáng)度在40 μmol·m-2·s-1，光 照 /黑 暗 為 10/14 h 連續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，液體培養(yǎng)物每天振搖至少2次(注:不要濺起到棉塞上)，每次轉(zhuǎn)接都經(jīng)鏡檢無雜菌雜藻，然后再擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.2.2 考察發(fā)狀念珠藻在 BG11和 BG110的生長狀況

分別將發(fā)狀念珠藻藻種研磨接種到BG110和BG11 500 mL液體培養(yǎng)基中，接種密度(A750)為 0.20～0.22。溫度控制在25 ±1 ℃，光照強(qiáng)度在40 ±2 μmol·m-2·s-1，連續(xù)培養(yǎng)18 d，每組3個(gè)重復(fù)。每隔1 d定時(shí)取樣，用722型可見分光光度計(jì)，于560 nm波長下測光吸收值。以生長時(shí)間為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線[4-6]。

2.2.3 溫度對發(fā)狀念珠藻生長影響

將生長良好的發(fā)狀念珠藻研磨接種到BG110500 mL液體培養(yǎng)基中，接種密度(A750)為0.20～0.22。溫度分別控制在 8、16、25、28、35 ℃，光照培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)18 d，每個(gè)培養(yǎng)箱光照強(qiáng)度都在40±2 μmol·m-2·s-1，每組 3 個(gè)重復(fù)。每隔1 d定時(shí)取樣，用722型可見分光光度計(jì)，于560 nm波長下測光吸收值。以生長時(shí)間為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線，考察光照強(qiáng)度對藻生長的影響[4-6]。

2.2.4 光照對發(fā)狀念珠藻生長影響

將生長良好的發(fā)狀念珠藻研磨接種到BG110500 mL液體培養(yǎng)基中，接種密度(A750)為 0.20 ～0.22。溫 度 控 制 在25±1℃，光 照 強(qiáng) 度 分 別 設(shè) 在 25、50、75 μmol·m-2·s-1連續(xù)培養(yǎng) 18 d，每組 3 個(gè)重復(fù)。每隔1 d定時(shí)取樣，用722型可見分光光度計(jì)，于750 nm波長下測光吸收值。以生長時(shí)間為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線，考察光照時(shí)間對藻生長的影響[4-6]。

3 結(jié)果

3.1 發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的分離純化

研磨清洗浸泡好的發(fā)菜原植體，逐漸顏色加深，經(jīng)鏡檢有大量的藻絲體釋放，同時(shí)有少量的原植體(見圖1)。接種于BG11固體培養(yǎng)基上，有一些平板上雖然生長大量的藻落，但濃度過大，藻落與藻落之間相連，并且有大量霉菌污染，選取適宜的濃度平板，挑選無雜藻雜菌污染的單藻落培養(yǎng)(見圖2)。為確保有些藻落混有雜藻或雜菌，研磨后涂平板，再挑取獨(dú)立的藻落進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，從而成功獲得純發(fā)狀念珠藻藻種。

圖1 經(jīng)研磨原植體釋放的藻絲體

圖2 接種于固體培養(yǎng)基上的單藻落

3.2 發(fā)狀念珠藻細(xì)胞的培養(yǎng)

3.2.1 考察發(fā)狀念珠藻在 BG11和 BG110生長狀況

藍(lán)藻培養(yǎng)基有 BG11、BG110、朱氏、HGZ等，發(fā)狀念珠藻屬于典型具異型胞的藍(lán)藻，可通過自身合成大量氮源，所以考察發(fā)狀念珠藻在BG11和BG110培養(yǎng)基上生長狀況，對以后大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用意義重大。BG11和BG110培養(yǎng)基中發(fā)狀念珠藻生長狀況如圖3所示。從圖3可以看出發(fā)狀念珠藻在BG110培養(yǎng)基中起初5 d生長速度明顯低于 BG11，延滯期約5 d，而生長到16 d后基本沒有太大區(qū)別，A750均達(dá)到0.46以上。從而說明將來大規(guī)模養(yǎng)殖時(shí)可考慮用BG110培養(yǎng)基培養(yǎng)。

圖3 在BG11和BG110培養(yǎng)基中發(fā)狀念珠藻生長狀況

3.2.2 溫度對發(fā)狀念珠藻生長影響

溫度是生物體生命活動(dòng)的一個(gè)重要影響因子。過高的溫度會(huì)導(dǎo)致生物體活性物質(zhì)變性;過低的溫度則導(dǎo)致生物體酶活力不夠，同樣影響生物體新陳代謝。分別接種培養(yǎng)在8、16、25、28、35 ℃ 光照培養(yǎng)箱內(nèi)，連續(xù)培養(yǎng)18 d，測定其生長狀況，結(jié)果見圖4。由圖4可知，低溫不利于形成一定量的生物量，在8℃培養(yǎng)18 d A750增加了不到0.1。較高溫度發(fā)狀念珠藻生長到后期產(chǎn)生生物量反而不如28℃，在28℃下發(fā)狀念珠藻生長最快，是該藻株最適生長溫度[7]。

圖4 溫度對發(fā)狀念珠藻生長影響

3.2.3 光照對發(fā)狀念珠藻生長影響

發(fā)狀念珠藻屬于光合自養(yǎng)型生物，利用環(huán)境中無機(jī)鹽及CO2就可以生長，但光照是不可或缺的。然而如果光照強(qiáng)度過高則會(huì)造成懸浮培養(yǎng)藻細(xì)胞傷害，反而不利于其生長。分別培養(yǎng)在 25、50、75 μmol·m-2·s-1光照培養(yǎng)箱內(nèi)，連續(xù)培養(yǎng)18 d，測定其生長狀況，光照強(qiáng)度對發(fā)狀念珠藻生長影響如圖5所示。由圖5可知，在培養(yǎng)初期較低光強(qiáng)其生長速度反而更適宜生長，等培養(yǎng)約 4 d 后 25 μmol·m-2·s-1生長較50 μmol·m-2·s-1慢，而在 75 μmol·m-2·s-1生長一直不佳，可能懸浮培養(yǎng)發(fā)狀念珠藻光飽和點(diǎn)要低于這個(gè)點(diǎn)，光太強(qiáng)反而對其生長造成嚴(yán)重影響。以后大批量培養(yǎng)時(shí)選擇50 μmol·m-2·s-1。

圖5 光照強(qiáng)度對發(fā)狀念珠藻生長影響

4 討論

目前，對發(fā)狀念珠藻的需求逐漸增加，人們大面積的采集，已造成該資源漸趨枯竭，且嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境，如何解決這個(gè)難題是藻類學(xué)家的當(dāng)務(wù)之急[1，8]。我們采自野外發(fā)菜原植體為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)平板培養(yǎng)，成功分離純化而得到單藻落。進(jìn)而進(jìn)行了其人工培養(yǎng)條件研究，篩選培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)證明在BG11培養(yǎng)基上發(fā)狀念珠藻生長比BG110上好，但到后期二者差異不大，可能是由于發(fā)狀念珠藻形成異型胞可自身固定空氣中氮的緣故，這點(diǎn)說明將來規(guī)?；a(chǎn)可直接選擇BG110，但平時(shí)小試驗(yàn)就選擇BG11。在溫度考證試驗(yàn)中可知28℃是該藻種最佳生長溫度，培養(yǎng)18 d其生物量可增加到2.3倍。而光照實(shí)驗(yàn)顯示選擇光強(qiáng)在50 μmol·m-2.s-1時(shí)發(fā)狀念珠藻生長最快。

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