劉 斌，陳德才

大骨節(jié)病的國際通用名稱為卡斯欽－貝克病(Kashin－Beck disease)，是一種地方性、畸形性骨關(guān)節(jié)病，基本病理改變?yōu)橥该鬈浌亲冃?、壞死，軟骨基質(zhì)降解丟失，最后出現(xiàn)繼發(fā)性退行性骨關(guān)節(jié)病。T－2(trichothecene mycotoxin－2)毒素是鐮刀菌在生長過程中產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物，為食物中常見的污染性霉菌毒素。在大骨節(jié)病區(qū)主食(主要是面粉和玉米)中檢測到T－2毒素明顯超標(biāo)，而通過換用不含超標(biāo)T－2毒素的糧食對(duì)大骨節(jié)病的防治有一定效果。因此，T－2毒素可能是大骨節(jié)病的病因之一[1]。筆者通過體外試驗(yàn)觀察T－2毒素對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響，以探討T－2毒素致關(guān)節(jié)損傷的具體機(jī)制，為T－2毒素致大骨節(jié)病學(xué)說進(jìn)一步提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

奧林巴斯IX70倒置式相差/熒光顯微鏡(日本Olympus公司);HTS7000 Plus BioAssay Reader(美國PE公司);T－2毒素(Sigma公司);0.5%四甲基偶氮唑鹽(成都鴻云科技公司);二甲基亞砜(上海啟迪化工有限公司);由 L－谷氨酰胺、碳酸氫鈉組成的DMEM/F－12液體培養(yǎng)基(Gibco11330)。

1.2 原代細(xì)胞培養(yǎng)

將2周齡新西蘭白兔行頸椎脫臼處死，無菌切取四肢關(guān)節(jié)軟骨，放入4℃的雙抗液中漂洗2次，再放入4℃磷酸鹽緩沖液中漂洗2次。用眼科小剪剪成糊狀，轉(zhuǎn)入小培養(yǎng)瓶中。加入0.25%的胰蛋白酶5 mL，在36.7℃恒溫水浴箱中振蕩消化30 min。加入10%小牛血清10 mL終止消化，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，以1 000 r/min離心8 min。吸取上清液，加入含0.2%Ⅱ型膠原酶的DMEM/F－12培養(yǎng)基5 mL，如此反復(fù)數(shù)次，制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入25 cm2正方斜口細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。5%CO2恒溫孵箱37℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長。

1.3 軟骨細(xì)胞鑒定

Ⅱ型膠原免疫組化染色法:待爬片的軟骨細(xì)胞在蓋玻片上長滿后，倒去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液沖洗，再用4%的中性甲醛固定30 min，以ABC法進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫組化染色，Ⅱ型膠原單克隆抗體作為一抗，濃度為25%。倒置顯微鏡下觀察攝影。結(jié)果Ⅱ型膠原免疫組化染色為陽性，細(xì)胞胞漿可見棕黃色顆粒，細(xì)胞核著色不明顯。

甲苯胺藍(lán)染色法:待爬片的軟骨細(xì)胞在蓋玻片上長滿后，倒去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液沖洗，置于10%的中性甲醛溶液中固定過夜，再用70%的酒精固定20 min，0.04%的甲苯胺藍(lán)染色20 min，迅速用無水乙醇漂洗1次，空氣中干燥，倒置顯微鏡下觀察攝影。結(jié)果甲苯胺藍(lán)染色為陽性，細(xì)胞胞漿可見淺藍(lán)色顆粒，細(xì)胞核著色不明顯。

1.4 干預(yù)試驗(yàn)

調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/L，按每孔200μL接于96孔板，放入5%的CO2孵箱中37℃下培養(yǎng)，觀察接種的軟骨細(xì)胞貼壁生長情況。48 h后，軟骨細(xì)胞完全貼壁，吸出96孔板中的原細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入質(zhì)量濃度為1，10，20，100μg/L的 T－2培養(yǎng)液，試驗(yàn)組和對(duì)照組各200μL，其中試驗(yàn)組每組4個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)1 d后，取出96孔板，取16孔，每孔加入20μL四甲基偶氮唑鹽溶液，接著放入5%的CO2孵箱中37℃下培養(yǎng)3.5 h。取出96孔板，吸出每孔中液體，再每孔加入200μL二甲基亞砜，放入5%的CO2孵箱中37℃下培養(yǎng)30 min。取出96孔板，反復(fù)吹打上述16孔，使結(jié)晶完全溶解，吸出每孔中的液體，轉(zhuǎn)入到另一96孔板，采用四甲基偶氮唑鹽法檢測，計(jì)算存活細(xì)胞相對(duì)數(shù)。分別于培養(yǎng)2，3，4，5 d時(shí)重復(fù)上述自“培養(yǎng)1 d后，取出96孔板……”開始的步驟。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)的形式表示。應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果

隨著T－2毒素質(zhì)量濃度的增加，各組細(xì)胞生長抑制越來越明顯，呈濃度依賴關(guān)系;隨著作用時(shí)間的延長，T－2毒素對(duì)軟骨細(xì)胞的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，呈時(shí)間依賴關(guān)系。不同質(zhì)量濃度T－2毒素對(duì)軟骨細(xì)胞的抑制作用在試驗(yàn)第5天時(shí)接近飽和(表1)。

表1 不同質(zhì)量濃度T－2毒素對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響(X±SD)

3 討論

T－2毒素是一類單端孢霉烯族真菌毒素中有代表性的毒素，是食物中常見的污染性霉菌毒。自1967年Manning和Bonner利用胰蛋白酶和膠原酶將軟骨細(xì)胞從軟骨基質(zhì)中分離出來后，研究者應(yīng)用體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞在關(guān)節(jié)軟骨疾病的發(fā)病機(jī)理方面進(jìn)行了很多探索[2]。筆者用2周齡新西蘭幼兔關(guān)節(jié)軟骨成功培養(yǎng)了軟骨細(xì)胞，并觀察了T－2毒素對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果T－2毒素質(zhì)量濃度越高，軟骨細(xì)胞增殖受抑制程度越重，主要原因是T－2毒素質(zhì)量濃度越高，對(duì)軟骨細(xì)胞DNA與蛋白質(zhì)合成影響越大。另外，試驗(yàn)表明T－2毒素對(duì)軟骨細(xì)胞的抑制作用在第5天時(shí)達(dá)到飽和，具體原因尚不清楚。但該試驗(yàn)至少說明，T－2毒素對(duì)軟骨細(xì)胞體外最佳干預(yù)時(shí)間為5 d。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測，T－2毒素在大骨節(jié)病關(guān)節(jié)病變的形成中起著一定作用。

[1]楊建伯.大骨節(jié)病病因研究報(bào)告[J].中國地方病學(xué)雜志，1995，14(4):201－204.

[2]Gibson GJ，Verner JJ，Nelson FR，et al.Degradation of the cartilage collagen matrix associated with changes in chondrocytes in osteoarthrosis.Assessment by loss of background fluorescence and immunodetection of matrix components[J].Journal of Orthopaedic Research，2001，19(1):33－42.