劉妍妍，于長(zhǎng)青，王瑞輝

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，革蘭氏陽(yáng)性[1]。研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌具有降低血清膽固醇水平、降低心血管疾病發(fā)病率的良好功效[2]。在20世紀(jì)70年代，Mann和Spoerry研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期大量飲用當(dāng)?shù)匾吧闂U菌發(fā)酵制品的非洲Masai部落人體內(nèi)血清膽固醇含量普遍較低[3]。迄今，已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，植物乳桿菌及其相關(guān)制品具有降低介質(zhì)及血清膽固醇的能力[4，5]。

隨著物質(zhì)生活水平的提高，冠心?。–HD）和動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病成為目前危害人類(lèi)健康、導(dǎo)致死亡的首要因素。研究表明，血清總膽固醇（TC）水平和冠心?。–HD）等心血管疾病發(fā)病率存在明顯的相關(guān)性。因此，通過(guò)益生菌降低血清膽固醇水平和血脂濃度成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一[6]，而發(fā)酵乳是益生菌最合適的載體[7]。

原料乳中膽固醇含量在0.298 mg·g-1左右，傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中膽固醇含量為0.215 mg·g-1左右。實(shí)驗(yàn)采用基于體外降膽模型篩選出來(lái)的1株具有降低血清膽固醇能力的植物乳桿菌ST-Ⅲ（CGMCC No.0847），與傳統(tǒng)酸奶菌種（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）制成復(fù)合發(fā)酵劑，研究了酸奶的發(fā)酵工藝參數(shù)，并通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究了植物乳桿菌對(duì)產(chǎn)品中膽固醇含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白砂糖（市售），純牛奶（市售），植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌（由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)畜產(chǎn)品研究室提供），鄰苯二甲醛、冰乙酸、濃硫酸、膽固醇、甲醇、氯仿均為分析純級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），HWS24恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司），冰箱（海爾集團(tuán)），MD100-2電子分析天平（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），DHG-9145A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司），LRH-280生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療機(jī)械廠），XSP-2CA型顯微鏡（上海上光新光學(xué)科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵酸奶工藝流程

1.3.2 植物乳桿菌發(fā)酵酸奶操作要點(diǎn)

（1）菌種的活化：在無(wú)菌條件下，用移液槍分別吸取1～2 mL保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌，用接種環(huán)挑取植物乳桿菌分別接種到鮮乳中，活化至活力穩(wěn)定。

（2）調(diào)制發(fā)酵劑：將鮮乳分裝于試管中和三角瓶中，每支試管中10 mL，每個(gè)三角瓶中100～150 mL，然后在120℃，5 min條件下進(jìn)行高壓滅菌。將滅菌乳冷卻至42℃進(jìn)行接種，接種量2%～3%，充分混勻后，將含有保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌的牛乳放到42℃恒溫培養(yǎng)箱中，含有植物乳桿菌的牛乳放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 h，三角瓶中菌種供生產(chǎn)發(fā)酵劑用，試管中的菌種放入冰箱內(nèi)作為原菌種保留。

（3）原料乳殺菌：原料乳加熱到60℃后加入8%的白砂糖，待白砂糖溶解后，置于85℃的水浴鍋中殺菌30 min。

（4）冷卻：將殺菌乳移置冷卻水中冷卻，當(dāng)溫度降至37～45℃時(shí)，在無(wú)菌條件下加入5%發(fā)酵劑，加入時(shí)要不斷攪拌，混勻，并活化0.5 min。

（5）灌裝：將接種好的乳快速無(wú)菌的灌裝于150 mL的容器中，容器必須事先干熱滅菌，灌裝后馬上封蓋移置42～45℃的恒溫箱中培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵2.5～3 h，發(fā)酵好的酸奶凝固無(wú)流動(dòng)，無(wú)乳清分離，發(fā)酵后于5℃下貯藏。

1.3.3 膽固醇含量的測(cè)定

采用鄰苯二甲醛比色法[8]。

1.3.4 植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌拮抗實(shí)驗(yàn)

選用植物乳桿菌與酸乳生產(chǎn)中常用的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為酸奶發(fā)酵劑。將以上3種菌按1∶1∶1的比例接種于滅菌的脫脂乳培養(yǎng)基上，放入42℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至凝乳，進(jìn)行鏡檢。

1.3.5 酸奶制備工藝參數(shù)對(duì)膽固醇含量影響單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 發(fā)酵溫度對(duì)膽固醇含量的影響

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分裝在4個(gè)250 mL的三角瓶中，加3%的發(fā)酵劑，菌種比例為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶2。分別在 37、39、41、43 ℃培養(yǎng) 4 h，測(cè)定發(fā)酵后的膽固醇含量，選出最佳發(fā)酵溫度。

1.3.5.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)膽固醇含量的影響

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分裝在4支250 mL的三角瓶中，加3%的發(fā)酵劑，菌種比例為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶2。在41℃下，分別培養(yǎng)3、4、5、6 h測(cè)定發(fā)酵后的膽固醇含量，選出最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.5.3 接種量對(duì)膽固醇含量的影響

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分裝在4支250 mL的三角瓶中，分別以1%、3%、5%、7%的接種量，41℃的溫度下發(fā)酵4 h，菌種比例為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶2。測(cè)定發(fā)酵后的膽固醇含量，選出最佳接種量。

1.3.5.4 混合菌種比例對(duì)膽固醇含量的影響

取1000 mL的原料乳，加入8%的白砂糖，分裝在4支250 mL的三角瓶中，以3%接種量，菌種比例分別以嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1、2∶1∶1 在 41 ℃的溫度下發(fā)酵 4 h，測(cè)定發(fā)酵后的膽固醇含量，確定最佳菌種比例。

1.3.6 酸奶制備工藝參數(shù)對(duì)膽固醇含量的影響正交實(shí)驗(yàn)

以膽固醇含量為指標(biāo)，通過(guò)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，研究不同發(fā)酵溫度，發(fā)酵時(shí)間，接種量及菌種比例對(duì)酸奶膽固醇含量的影響，確定最佳工藝參數(shù)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and level of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌拮抗實(shí)驗(yàn)

顯微鏡下觀察凝乳中發(fā)酵劑菌狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，3種菌形態(tài)清晰，生長(zhǎng)良好，并且3種菌基本保持了1∶1∶1的初始比例，這表明3種菌無(wú)拮抗，能夠互利共生，可以混合作為酸乳發(fā)酵劑使用。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)膽固醇含量的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)酸奶中膽固醇含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)酸奶中膽固醇含量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on cholesterol content in yogurt

由圖1可知，加入復(fù)合菌發(fā)酵后，不同發(fā)酵溫度下酸奶中膽固醇含量都低于正常酸奶，但在39℃下膽固醇含量最低，為 0.17 mg·g-1。

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)膽固醇含量的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶中膽固醇含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶中膽固醇含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on cholesterol content in yogurt

由圖2可知，加入復(fù)合菌發(fā)酵后，不同發(fā)酵時(shí)間下酸奶中膽固醇含量都低于正常酸奶，但在5 h下膽固醇含量最低，為0.14 mg·g-1，所以最佳發(fā)酵時(shí)間為5 h。

2.2.3 接種量對(duì)膽固醇含量的影響

不同接種量對(duì)酸奶中膽固醇含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酸奶接種量對(duì)酸奶中膽固醇含量的影響Fig.3 Effect of inoculation quantity on cholesterol content in yogurt

由圖3可知，在接種量1%～7%范圍內(nèi)，隨著接種量的增加酸奶中膽固醇含量下降，接種量在5%以后，酸奶中膽固醇含量變化不明顯，所以酸奶發(fā)酵的最佳接種量是5%，膽固醇含量為0.172 mg·g-1。

2.2.4 菌種比例對(duì)膽固醇含量的影響

不同菌種比例對(duì)酸奶中膽固醇含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 混合菌種比例對(duì)酸奶中膽固醇含量的影響Fig.4 Effect of lactobacilli rate on cholesterol content in yogurt

由圖4可知，菌種比例為嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1∶2時(shí)，酸奶中的膽固醇含量最低，為0.155 mg·g-1，隨著菌種比例的變化，酸奶中的膽固醇含量有上升的趨勢(shì)，所以最佳菌種比例為1∶1∶2。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以膽固醇含量為指標(biāo)，研究發(fā)酵溫度，發(fā)酵時(shí)間，接種量，菌種比例對(duì)膽固醇含量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal experiment

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知四個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響程度的主次關(guān)系是D＞C＞A>B，最優(yōu)組合為A3B1C1D2，即發(fā)酵溫度為41℃、發(fā)酵時(shí)間4 h、接種量3%、菌種比例 1∶1∶2。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與對(duì)比實(shí)驗(yàn)

在最佳工藝條件下發(fā)酵酸奶，重復(fù)3次，以檢驗(yàn)最優(yōu)工藝參數(shù)的降膽固醇的效果，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of validation experiment

由表3可知，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值為0.122（mg·g-1）。

實(shí)驗(yàn)又對(duì)沒(méi)有植物乳桿菌參與發(fā)酵的酸奶中膽固醇的含量進(jìn)行了對(duì)比測(cè)定，對(duì)照樣品中3組平行樣的均值為 0.215（mg·g-1）。

3 結(jié)論

利用植物乳桿菌發(fā)酵酸奶，最佳工藝條件為發(fā)酵溫度41℃、發(fā)酵時(shí)間4 h、接種量為3%、菌種比例 1∶1∶2（嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌∶植物乳桿菌），酸奶具有良好的品質(zhì)，膽固醇含量為0.122 mg·g-1。

原料乳中膽固醇平均含量為0.298 mg·g-1，由嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌發(fā)酵的酸奶中膽固醇含量為0.215 mg·g-1，而添加植物乳桿菌的發(fā)酵酸奶膽固醇平均含量為0.122 mg·g-1，植物乳桿菌參與下的發(fā)酵工藝可使產(chǎn)品中膽固醇的含量明顯降低。

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