彭 翔 劉伏友 孫 林 李 瑛 肖 力 李 軍

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是治療終末期腎功能衰竭的有效方法之一。腹膜纖維化導(dǎo)致的超濾失敗不僅嚴(yán)重影響患者的生存與生活，而且是造成大量患者退出PD的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，非生物相容性的PD液長(zhǎng)期刺激人腹膜間皮細(xì)胞(human mesothelial cell，HPMCs)誘導(dǎo)其發(fā)生上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腹膜纖維化早期可逆階段，因此抑制EMT被認(rèn)為是防治腹膜纖維化病變的理想方法[1]，降低PD液的非生物相容性以減緩腹膜間皮細(xì)胞EMT的進(jìn)程逐漸成為腎臟病專業(yè)研究的熱點(diǎn)。鈣離子是PD液中的主要電解質(zhì)成分之一，對(duì)于維持正常鈣磷代謝、防治腎性骨病意義重大。美國(guó)National Kidney EFoundation(NKF) K/DOQI 2003關(guān)于慢性腎臟病骨代謝及其疾病的臨床實(shí)踐指南建議血液透析(HD)和PD的鈣離子濃度應(yīng)當(dāng)為1.25 mmol/L，以減少高鈣血癥及繼發(fā)性血管和軟組織鈣化[2]。由于CKD患者骨代謝及其疾病復(fù)雜多變，目前應(yīng)用于臨床的PD液鈣離子濃度為1.0～1.75 mmol/L，以便個(gè)體化治療。但迄今尚缺乏不同鈣濃度對(duì)人腹膜間皮細(xì)胞EMT的相關(guān)研究。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、成纖維細(xì)胞特異蛋白(FSP1)、波形蛋白(Vimentin)是判斷腹膜間皮細(xì)胞是否發(fā)生EMT的三種標(biāo)志性蛋白質(zhì)，本文通過觀察不同濃度鈣離子對(duì)體外培養(yǎng)的HPMCs中E-cadherin、FSP1、Vimentin的影響，試圖尋找較為理想鈣離子濃度，為防治腹膜纖維化提供新的思路。

材料與方法

主要試劑Chamber slides(美國(guó)Corning)、小鼠抗人E-cadherin抗體(美國(guó)CST)，小鼠兔抗Vimentin抗體(美國(guó)abcam)，抗FSP1抗體(美國(guó)Cusabio)、抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠和抗兔IgG二抗(北京中杉)、FITC標(biāo)記二抗和TRICT標(biāo)記二抗(美國(guó)santa cruz)、低糖不含鈣DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青)、CaCl2·2H2O(美國(guó)Sigma)、BCA蛋白濃度監(jiān)測(cè)試劑盒和RIPA裂解液(上海碧云天)、ECL顯影液(美國(guó)Millipore)。

細(xì)胞培養(yǎng)與試驗(yàn)分組HPMCs細(xì)胞株(HMrSV5)由上海第一醫(yī)院姚建教授饋贈(zèng)。HMrSV5生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、2 mmol/L的L-谷氨酰胺的低糖含鈣DMEM培養(yǎng)液中，5%的CO2、37℃孵育培養(yǎng)增生傳代；按1×106/孔密度將上述細(xì)胞均勻種于六孔培養(yǎng)板和四孔chamber slides中，當(dāng)細(xì)胞融合80%則改用無(wú)血清含鈣DMEM同步，24h后按實(shí)驗(yàn)要求更換為不同鈣濃度(0.25、0.75、1.25、1.75、2.25 mmol/L)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液共同孵育48h。同時(shí)設(shè)不含鈣的DMEM組為對(duì)照組。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

免疫蛋白印記分析[3]HMrSV5細(xì)胞總蛋白的提取采用RIPA裂解液。蛋白含量采用BCA試劑盒以紫外分光度法在562 nm處進(jìn)行濃度測(cè)定。取總蛋白30 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)置聚偏氟乙烯(PVDF)膜，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)印效果，然后用含4%牛血清白蛋白的PBST 4℃封閉2h，洗膜后分別加入小鼠抗人E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶800)、FSP1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)4℃雜交過夜。再用1∶10 000 HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG進(jìn)行二抗雜交。加ECL液于膜上，反應(yīng)5 min后置于柯達(dá)4 000 MM化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光成像，采用圖像分析軟件進(jìn)行吸光度分析。每份標(biāo)本以各自β-actin作為基準(zhǔn)，校正檢測(cè)標(biāo)本的蛋白相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

間接免疫熒光染色按文獻(xiàn)[3]方法，Chamber Slides中生長(zhǎng)的細(xì)胞處理后，以4%多聚甲醛4℃固定20 min后封閉。以含檢測(cè)抗體(1∶400)的PBS孵育細(xì)胞過夜，充分洗滌后，用含熒光FITC或TRICT標(biāo)記二抗(1∶200)的PBS室溫孵育1h。觀察前用含DAPI的封片液封片。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用t檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 13.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同濃度鈣對(duì)HMrSV5細(xì)胞表達(dá)E-cadherin蛋白的影響Western印跡結(jié)果顯示，對(duì)照組(無(wú)鈣培養(yǎng)液組)HMrSV5細(xì)胞48h時(shí)基本無(wú)E-cadherin表達(dá)；不同濃度鈣作用于HMrSV5 48h，鈣0.75 mmol/L組E-cadherin蛋白表達(dá)開始升高并呈劑量依賴性上調(diào)，鈣1.25 mmol/L組E-cadherin達(dá)到頂峰，隨后逐漸降低。2.25 mmol/L組仍高于對(duì)照組(圖1)。

圖1 各組HMrSV5細(xì)胞E-cadherin蛋白的表達(dá)(蛋白免疫印跡)

間接免疫熒光結(jié)果也證實(shí)，與對(duì)照組比較，不同濃度含鈣培養(yǎng)液作用于HMrSV5細(xì)胞48h，其表達(dá)的E-cadherin熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性增強(qiáng)，鈣1.25 mmol/L組最強(qiáng)，隨后逐漸降低(圖2)。

不同濃度鈣對(duì)HMrSV5細(xì)胞表達(dá)Vimentin蛋白的影響Western印跡結(jié)果顯示，對(duì)照組(無(wú)鈣培養(yǎng)液組)HMrSV5細(xì)胞有低水平Vimentin表達(dá)；不同濃度鈣作用于HMrSV5 48h，鈣1.75 mmol/L組Vimentin表達(dá)開始升高并呈劑量依賴性逐漸上調(diào)(圖3)。

間接免疫熒光結(jié)果也證實(shí)，不同濃度含鈣培養(yǎng)液作用于HMrSV5細(xì)胞48h，自鈣1.25 mmol/L組始，HMrSV5細(xì)胞ESP1熒光強(qiáng)度呈劑量依賴性增強(qiáng)(圖4)。與對(duì)照組比較，不同濃度含鈣培養(yǎng)液作用于HMrSV5細(xì)胞48h，鈣1.75、2.25 mmol/L組表達(dá)的Vimentin熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(圖4)。

圖2 各組HMrSV5細(xì)胞E-cadherin蛋白的表達(dá)(間接免疫熒光染色，×600)

不同濃度鈣對(duì)HMrSV5細(xì)胞表達(dá)FSP1蛋白的影響Western印跡結(jié)果顯示，對(duì)照組(無(wú)鈣培養(yǎng)液組)HMrSV5細(xì)胞有極低水平FSP1表達(dá)；不同濃度鈣作用于HMrSV5 48h，自鈣1.75 mmol/L組開始FSP1表達(dá)增強(qiáng)并呈劑量依賴性上調(diào)(圖5)。

討 論

作為一種終末分化的上皮細(xì)胞，腹膜間皮細(xì)胞在PD過程中可發(fā)生EMT[4]。近來(lái)研究顯示，腹膜間皮細(xì)胞中與EMT相關(guān)的幾種蛋白表達(dá)均受到鈣離子調(diào)控，如上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin和FSP1[5-7]。Zamoner等[8]發(fā)現(xiàn)，鈣離子通道開放、上皮細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高可導(dǎo)致Vimentin磷酸化。在體外培養(yǎng)的人角化細(xì)胞中，E-cadherin是一種鈣離子依賴的黏附蛋白，在低鈣離子濃度(30 μmol/L)培養(yǎng)液中，細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)且失去黏附功能，鈣離子濃度增加(1.0 mmol/L)時(shí)，細(xì)胞黏附功能恢復(fù)[9]。FSP1本身就屬于細(xì)胞內(nèi)鈣結(jié)合蛋白中鈣調(diào)蛋白-S100-肌鈣蛋白超家族[10]，鈣離子對(duì)它的功能至關(guān)重要。鑒于以上研究結(jié)果我們?cè)O(shè)想PD液中鈣離子濃度改變可能會(huì)影響腹膜間皮細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

生理?xiàng)l件下腹膜間皮細(xì)胞高表達(dá)E-cadherin，但不表達(dá)或極少表達(dá)FSP1，而Vimentin存在一定量的基礎(chǔ)表達(dá)。本研究在體外培養(yǎng)條件下證實(shí)，在無(wú)鈣條件下，腹膜間皮細(xì)胞幾乎沒有E-cadherin表達(dá)且細(xì)胞黏附性顯著降低，細(xì)胞極易被胰酶消化脫落。鈣離子以劑量依賴性方式誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞表達(dá)E-cadherin逐漸增高，在生理鈣濃度(1.25 mmol/L)時(shí)其達(dá)到頂峰。與E-cadherin的鈣濃度依賴性相符合[9]。高于生理濃度鈣(≥1.25 mmol/L)能抑制E-cadherin表達(dá)，使Vimentin和FSP1表達(dá)上調(diào)，提示高鈣可能通過誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而影響間皮細(xì)胞功能，并可能以此參與腹膜纖維化的發(fā)生。

圖3 各組HMrSV5細(xì)胞Vimentin蛋白的表達(dá)(蛋白免疫印跡)

細(xì)胞內(nèi)鈣離子是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中關(guān)鍵的第二信使，參與介導(dǎo)骨形成、肌肉收縮、激素分泌、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增生以及凝血等多種基本生理過程。作為一種分化成熟的上皮細(xì)胞，腹膜間皮細(xì)胞主要是以鈣離子通道的方式實(shí)現(xiàn)鈣離子由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞外鈣離子濃度改變勢(shì)必影響細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生理功能的游離鈣離子濃度。E-cadherin主要與鈣緊張素(catenin)和肌動(dòng)蛋白絲的細(xì)胞骨架連接蛋白形成網(wǎng)絡(luò)，參與完成上皮細(xì)胞的穩(wěn)定性黏附[11]。FSP1主要參與細(xì)胞骨架-膜的相互作用、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等[12]。在鈣離子存在時(shí)，F(xiàn)SP1二聚化結(jié)合P53羧基末端并使之脫離APC泛素化途徑，從而提高β-catenin水平，增加細(xì)胞的遷移性并誘導(dǎo)血管發(fā)生，所以FSP1在促進(jìn)細(xì)胞EMT中的關(guān)鍵作用與鈣離子息息相關(guān)[13]。而Vimentin除了參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡外，主要介導(dǎo)細(xì)胞黏附與遷移[14]，它的表達(dá)上調(diào)是衡量細(xì)胞是否發(fā)生EMT改變的重要標(biāo)志。我們觀察到，在無(wú)鈣培養(yǎng)條件下E-cadherin、FSP1、Vimentin表達(dá)均為最低； FSP1、Vimentin蛋白表達(dá)在鈣離子濃度0～0.75 mmol/L區(qū)間均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而E-cadherin表達(dá)呈濃度相關(guān)性顯著增加。在這個(gè)低濃度區(qū)間內(nèi)發(fā)生的蛋白表達(dá)變化我們認(rèn)為可能并不屬于EMT范疇，而是由于鈣的缺乏導(dǎo)致這三種蛋白結(jié)構(gòu)性的合成障礙。雖然鈣同時(shí)參與調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)，但E-cadherin對(duì)鈣的依賴明顯比Vimentin和FSP1的表達(dá)更強(qiáng)。人體血清中鈣離子的正常濃度為0.94～1.26 mmol/L，我們推測(cè)，在高鈣環(huán)境下此三種蛋白質(zhì)表達(dá)所發(fā)生的變化可能系腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT改變所致。

圖4 各組HMrSV5細(xì)胞Vimentin蛋白與FSP1蛋白的表達(dá)(間接免疫熒光染色 ×600)

圖5 各組HMrSV5細(xì)胞FSP1蛋白的表達(dá)(蛋白免疫印跡)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，使用含鈣1.25 mmol/L的培養(yǎng)液誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞中的E-cadherin表達(dá)最高，而Vimentin和FSP1表達(dá)顯著低于含鈣1.75 mmol/L組且與低于鈣1.25 mmol/L組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這提示鈣1.25 mmol/L組的細(xì)胞EMT程度最低，理論上使用鈣離子濃度為1.25 mmol/L的PD液時(shí)，對(duì)患者體內(nèi)腹膜間皮細(xì)胞造成的EMT損傷可能最小。

本研究結(jié)果證實(shí)鈣離子濃度的變化能誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞E-cadherin、FSP1、Vimentin蛋白表達(dá)發(fā)生變化，提示鈣離子可能是參與調(diào)控間皮細(xì)胞EMT的一個(gè)重要因素。使用含鈣1.25 mmol/L的PD液不但可以糾正鈣磷代謝失衡、防治異位鈣化，而且對(duì)腹膜間皮細(xì)胞EMT有一定的防治作用。

本研究結(jié)果均來(lái)自體外實(shí)驗(yàn)，仍需進(jìn)一步在體內(nèi)研究中加以驗(yàn)證，且鈣離子誘導(dǎo)人腹膜間皮細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)變化過程中所涉及的分子機(jī)制及其干預(yù)研究，也是我們?nèi)蘸笱芯康姆较颉１狙芯坑兄谡J(rèn)識(shí)腹膜間皮細(xì)胞EMT的發(fā)病機(jī)制，也為進(jìn)一步探討降低PD液生物不相容性、防止腹膜纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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