趙仲麟，頓文濤，李 燕，金顯春，楊國玉，蘇同福，袁 超

(1.河南農(nóng)業(yè)大學理學院，河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學信息化管理處，河南 鄭州 450002;3.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002)

以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認識生命現(xiàn)象已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學發(fā)展的主要方向.研究蛋白質(zhì)首先要得到高度純化并具有生物活性的蛋白質(zhì)，常用于純化蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法有凝膠過濾和離子交換等，但是這些方法要求操作人員有較為豐富的經(jīng)驗.親和層析也是一種常用的蛋白純化方法，利用共價連接有特異配體的層析介質(zhì)分離蛋白質(zhì)，具有高效、快速、簡便等優(yōu)點，缺點是親和標簽可能對目的蛋白產(chǎn)生影響，常需要使用蛋白酶除去親和標簽，而蛋白酶處理有時非特異，且效率較低，同時也將增加蛋白純化的步驟.內(nèi)含肽(intein)是類似內(nèi)含子的蛋白質(zhì)等價物，通過翻譯后蛋白剪接過程催化其自身從宿主蛋白上脫離［1，2］.由內(nèi)含肽介導的蛋白質(zhì)剪接原理發(fā)展出多種新技術(shù)已用于蛋白質(zhì)工程和化學生物學研究中［3～5］.內(nèi)含肽介導的蛋白質(zhì)純化方法可通過親和層析的方法得到無親和標簽的蛋白，剪切能夠在不使用蛋白酶的情況下切斷肽鍵.CHONG等［6］利用釀酒酵母 Sce VMA內(nèi)含肽進行了蛋白純化.目的蛋白被融合在內(nèi)含肽的N端，內(nèi)含肽的C端連接到環(huán)狀芽胞桿菌的幾丁質(zhì)結(jié)合域(CBD)的親和尾上，硫醇誘導內(nèi)含肽N端的肽鍵的斷裂，從固定在柱上的融合蛋白上釋放目的蛋白.ZHAO等［7］利用雙內(nèi)含肽的方法對綠色熒光蛋白進行了純化.內(nèi)含肽蛋白純化系統(tǒng)的優(yōu)點在于該方法簡單、高效，可得到無載體來源氨基酸的蛋白質(zhì)，分離蛋白質(zhì)不需要使用昂貴的蛋白酶切除親和標簽.本研究利用來源于藍綠藻Synechocystis sp.PCC6803的DnaB內(nèi)含肽的剪切特性，純化綠色熒光蛋白.

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

載體pTWIN1和大腸桿菌E.coli ER2566由NEB公司徐明群博士惠贈.

1.2 酶和試劑

限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、幾丁質(zhì)樹脂均購于NEB(北京)公司;高保真DNA聚合酶購自全式金公司;其它試劑均為分析純.

1.3 綠色熒光蛋白基因(gfp)的克隆

根據(jù)gfp基因序列設(shè)計引物，分別加入位點EcoR I和Xho I(下劃線部分).引物由上海生物工程有限公司合成，分別為:gfpF:5’-CCAGAATTCAT GCGTAAAGGAGAAGAAC-3’，gfpR:5’-CCACTCGA GTCATTTGTATAGTTCATC-3’.以含 gfp基因的質(zhì)粒pG6th為模板，PCR擴增出全長的綠色熒光蛋白基因.PCR參數(shù)為:94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸 50 s，共 30 個循環(huán)，最后72℃補充延伸10 min.

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳純化回收，用EcoR I和Xho I雙酶切，同時使用相同內(nèi)切酶對質(zhì)粒pTWIN1酶切.用T4 DNA連接酶將酶切后的pTWIN1和gfp于4℃連接過夜.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ER2566，涂布在含100 mg·L－1的氨芐霉素抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，得到含重組質(zhì)粒pTWG的大腸桿菌.

1.5 綠色熒光蛋白的表達與純化

將含重組質(zhì)粒pTWG的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子接種于LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r·min－1過夜培養(yǎng)后，按1%接種量轉(zhuǎn)接入100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至 OD600為0.6，加入 IPTG使終濃度達到0.3 mmol·L－1，15 ℃培養(yǎng)16 h.離心收集菌體，用10 mL 緩沖液 B1(20 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.0，0.5 mol·L－1NaCl，1 mmol·L－1EDTA)將菌體重懸，超聲波破碎細胞，后19 000×g離心30 min，上清液即為澄清的細胞粗提物.

將3 mL幾丁質(zhì)樹脂倒入柱中，30 mL B1緩沖液(pH 7.0)，4℃進行柱平衡.將澄清的細胞粗提物緩慢加入幾丁質(zhì)柱，流速約為1.0 mL·min－1.用50 mL的緩沖液徹底洗柱，流速為3 mL·min－1.停止柱流后，pH 7.0 條件下，20 ℃ 放置 12 h，后用10 mL B1緩沖液洗脫目的蛋白，SDS-PAGE電泳檢測.

1.6 激光共聚焦影像試驗

從含pTWG質(zhì)粒的大腸桿菌2566平板上挑取單菌落，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐100 mg·L－1)，加入 IPTG，15 ℃誘導培養(yǎng) 16 h后，5 000×g離心5 min，收集細胞，棄上清液.用無菌水洗菌體3次，取10 μL至于載玻片上，100倍油鏡鏡檢，使用德國Leica TCS SP2激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，激發(fā)波長為488 nm.

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色熒光蛋白基因的克隆及表達載體構(gòu)建

根據(jù)綠色熒光蛋白gfp基因序列設(shè)計引物，PCR擴增出1條長度約為720 bp的條帶(圖1)，經(jīng)測序驗證表明基因無突變.

圖1 gfp基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR result of gfp gene

將PCR產(chǎn)物與酶切后的pTWIN1載體連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2566感受態(tài)細胞.通過氨芐霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR驗證表明已成功將gfp基因連接到表達載體上，產(chǎn)生載體命名為pTWG(圖2).其中Ssp DnaB內(nèi)含肽融合于gfp基因的N端，幾丁質(zhì)親和域CBD融合于DnaB內(nèi)含肽的N端，作為親和純化標簽.

2.2 蛋白誘導表達及純化

本研究使用0.3 mmol·L－1的 IPTG誘導蛋白表達.細胞粗提液通過親和層析柱時，內(nèi)含肽－綠色熒光蛋白融合體結(jié)合于幾丁質(zhì)樹脂柱上.之后于20℃，pH 7.0條件下放置12 h誘導內(nèi)含肽的自剪切活性，將綠色熒光蛋白從融合前體上脫離，后用緩沖液B1洗脫目的蛋白.SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果只出現(xiàn)1個條帶，大小約29 kD(圖3)，符合綠色熒光蛋白的理論分子量，結(jié)果表明純化得到的綠色熒光蛋白具有正確的大小，且具有較高的純度.

2.3 菌體激光共聚焦掃描結(jié)果

綠色熒光蛋白較適合在低溫下、長時間誘導其表達［8］，因此本研究中采用15℃誘導16 h，取得了較好的表達效果.表達有綠色熒光蛋白的E.coli ER2566在488 nm激發(fā)下，菌體呈現(xiàn)明亮的綠色熒光.從菌體在明場中的光學影像(圖4－A)和熒光掃描圖像(圖4－B)可見，所有大腸桿菌中均有綠色熒光蛋白表達，表明綠色熒光蛋白經(jīng)內(nèi)含肽介導的純化后具有正確的功能和良好的活性，可作為細胞的分子影像標記.

圖4 含綠色熒光蛋白表達的E.coli ER2566共聚焦顯微鏡圖像Fig.4 Confocal image of E .coli ER2566 strains with GFP expression

3 結(jié)語

1)本研究利用內(nèi)含肽介導的蛋白質(zhì)剪切反應純化綠色熒光蛋白.在細胞生物學與分子生物學領(lǐng)域中，綠色螢光蛋白經(jīng)常作為生物探針，是一種重要的標記基因.其穩(wěn)定性好，顏色可見，易于檢測.基于以上的優(yōu)點，本研究使用綠色熒光蛋白作為純化的目的蛋白.內(nèi)含肽催化的蛋白轉(zhuǎn)剪接反應具有高效、反應條件溫和等特點，在離體和活體條件下均能進行蛋白質(zhì)的剪接反應.

2)Ssp DnaB內(nèi)含肽的剪切與溫度和pH值有很大關(guān)系.在pH 7.0，溫度16～23℃有較好的剪切活性.本研究利用單步反應，采用20℃，pH 7.0條件下，誘導內(nèi)含肽自剪切活性的發(fā)生，從而純化目的蛋白.純化過程中無需添加任何其他試劑，系統(tǒng)中的作為親和標簽的幾丁質(zhì)結(jié)合域仍留在親和柱上，得到的目的蛋白無親和標簽，減少了親和標簽對于蛋白質(zhì)的影響.

［1］PERLER F B.Protein splicing of inteins and hedgehog autoproteolysis:structure，function，and evolution［J］.Cell，1998，92(1):1 －4.

［2］PAULUS H.Protein splicing and related forms of protein autoprocessing［J］.Annu Rev Biochem，2000，69:447－496.

［3］頓寶慶，陸 偉，趙仲麟，等.熒光假單胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介導的活性恢復［J］.科學通報，2006，52(12):1479 －1481.

［4］趙仲麟，馬 鑫，林 敏，等.內(nèi)含肽介導的蛋白質(zhì)環(huán)化進展［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導報，2009，11(3):19－24.

［5］任元濤，方宏清，周長林，等.蛋白質(zhì)剪接研究進展［J］. 生物技術(shù)通訊，2010，21(4):575 －580.

［6］CHONG S R，COMB D G，SCOTT M E，et al.Singlecolumn purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element［J］.Gene，1997，192(2):271 －281.

［7］ZHAO Z L，LU W，DUN B Q，et al.Purification of green fluorescent protein using a two-intein system［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，77(5):1175 －1180.

［8］ZHAO Z L，MA X，LI L，et al.Protein cyclization enhanced thermostability and exopeptidase-resistance of green fluorescent protein［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2009，20:460－466.