王永生，周 欣，楊 霞，陳 陸，王川慶，王澤霖

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

雞傳染性法氏囊病是由雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的雛雞的一種急性傳染病.目前，該病主要通過疫苗接種來防控，除給雛雞使用活疫苗免疫外，通常還給種雞注射滅活疫苗使出殼雛雞獲得母源抗體，使其避免在生命早期感染本病.雞傳染性法氏囊病滅活疫苗通常采用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)培養(yǎng)病毒液來制備，因IBDV在CEF細(xì)胞上增殖滴度不高，所以免疫效果欠佳.DF-1細(xì)胞是CEF的傳代細(xì)胞系，具有永生性，可以無限地繁殖，具備比CEF細(xì)胞更大的增殖能力［1］，目前已被應(yīng)用于禽類病毒的增殖、重組蛋白的表達(dá)及動物和人類疫苗的生產(chǎn).鑒于傳統(tǒng)工藝培養(yǎng)的IBDV病毒液毒價不高，需要高倍濃縮，增加成本，且容易被外源病原污染，尋找一種新的細(xì)胞來替代雞胚成纖維細(xì)胞增殖雞傳染性法氏囊病病毒是亟待解決的問題之一.本試驗(yàn)旨在研究IBDV HQ株細(xì)胞毒在DF-1細(xì)胞上的培養(yǎng)特性和最佳增殖條件，為用雞胚源DF-1細(xì)胞系代替?zhèn)鹘y(tǒng)的CEF細(xì)胞來培養(yǎng)IBDV，制備高效的傳染性法氏囊滅活疫苗奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞傳染性法氏囊病病毒 HQ株細(xì)胞毒，是國內(nèi)IBD滅活聯(lián)苗的制苗毒株，適應(yīng)在CEF細(xì)胞上生長，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所分離、鑒定、培育和保存.

1.1.2 雞胚源DF-1細(xì)胞系 從美國典型菌種保藏中心(ATCC)引入，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究所傳代、建細(xì)胞庫和保管.

1.1.3 試劑 營養(yǎng)液為體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(武漢三利)的 DMEM/F12培養(yǎng)基(GIBCO，lot:NO.862843).維持液為體積分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基(GIBCO，lot:NO.862843).葡萄糖測定試劑盒，購自中生北控生物科技股份有限公司(lot:112651).

1.2 方法

1.2.1 IBDV HQ株在DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞上的適應(yīng)性比較 將IBDV HQ株在長成單層的CEF上連續(xù)繁殖3代，并按Reed-Muench法［2］測定病毒液的毒價(TCID50·mL－1)，然后作為種毒液，分別在T25方瓶中DF-1單層細(xì)胞上和Vero單層細(xì)胞上各傳5代.每天觀察病變情況，在細(xì)胞出現(xiàn)80%以上病變時收毒，凍存后測定各代毒的毒價.如無病變出現(xiàn)，120 h后收毒，并以相同方法連續(xù)盲傳至第5代，收獲的毒液凍存后也測定毒價.

1.2.2 IBDV在方瓶中最佳接毒量及最佳收毒時間的確定 取T25方瓶39個，每個方瓶接種細(xì)胞3×106個，細(xì)胞長成單層后，取出3瓶進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，其余分成3組進(jìn)行接毒.每組接毒量(毒價為8.0 mL－1)分別為 0.5%，1%，2%.于接毒后 24，36，48，60 h從每組各取3瓶，凍存.待取樣完畢一起測定毒價，并計(jì)算每3個方瓶的平均毒價.根據(jù)所測TCID50的最大值確定最佳收毒時間，并計(jì)算出最佳的MOI(病毒感染復(fù)數(shù)即MOI為感染時每1個細(xì)胞的病毒感染量，即接入病毒TCID50·mL－1值乘以體積再除以接毒時的細(xì)胞總數(shù)).

1.2.3 不同pH值對IBDV增殖的影響 取T25瓶9個，每3個1組.每瓶接種細(xì)胞3×106個，并按1%量(毒價為8.0 mL－1)接毒.維持液的pH值分別調(diào)至 6.6，7.0，7.6，確定病毒增值時維持液的最佳pH值.

1.2.4 不同接毒時間對IBDV增殖的影響 方法同1.2.2，第1組至第4組分別在細(xì)胞生長的24，48，72，96 h接毒，比較4個不同時間接毒組的IBDV增殖動態(tài).

1.2.5 不同血清濃度對IBDV增殖的影響 取T25方瓶48個，分成4組.每瓶接種細(xì)胞3×106個，并按1%量接毒(毒價為8.0 mL－1).維持液的體積分?jǐn)?shù)分別為0%，2%，5%，8%胎牛血清的培養(yǎng)基(DMEM/F12).比較各不同血清濃度組IBDV增殖動態(tài).

1.2.6 IBDV繁殖時上清毒價與細(xì)胞全懸液毒價的關(guān)系 取T25方瓶39個，每瓶接種細(xì)胞3×106個，待細(xì)胞長成單層后取出3瓶進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，余下的全部接毒，接毒量為1%(毒價為8.0 mL－1).接毒后，從6 h開始取樣，每隔6 h取1次，每次取3瓶，連續(xù)取12次.每次取樣時先將3瓶上清混勻，取出適量上清后，再將其余液體平均分配到3個方瓶中，凍融后混合作為細(xì)胞全懸液.待取樣完畢后一起測上清液與細(xì)胞全懸液的毒價.另外，將所取上清液同時用于測定糖耗，以了解接毒后IBDV增殖過程中的細(xì)胞狀態(tài)，繪制病毒增殖曲線圖和糖耗動態(tài)圖.糖耗采用葡萄糖氧化酶法(GODPOD)測定［3］，單位為 g·L－1.

2 結(jié)果與分析

2.1 IBDV HQ株在DF-1細(xì)胞和Vero細(xì)胞上的適應(yīng)性比較

IBDV HQ株按2%～5%接毒量在CEF上連傳3代，各代均在48～72 h出現(xiàn)病變，細(xì)胞逐步圓縮、脫落，呈拉網(wǎng)狀，72 h后收毒，其TCID50為7.0 ～7.5 mL－1.

IBDV HQ株在DF-1細(xì)胞上接毒后，第1代就出現(xiàn)病變，TCID50毒價達(dá)7.5 mL－1，在 DF-1 細(xì)胞上按1%量接毒連傳5代，各代均出現(xiàn)明顯病變.接毒12 h后開始有病變，24～48 h細(xì)胞逐步圓縮，脫落，不同程度的拉網(wǎng)狀，36～48 h收毒，其TCID50在8.0 ～8.5 mL－1之間.表明 IBDV HQ 株在 DF-1 細(xì)胞上非常適應(yīng)，較在CEF細(xì)胞上更敏感，出現(xiàn)病變快，毒價更高(表1).

IBDV HQ株在接入Vero細(xì)胞繁殖的第1代，出現(xiàn)了輕微病變，但細(xì)胞沒有圓縮、脫落.在以后的4代中，細(xì)胞病變情況均不如第1代，沒有出現(xiàn)類似于CEF上的細(xì)胞病變.測定TCID50，沒有毒價，重復(fù)試驗(yàn)也取得類似結(jié)果.可見經(jīng)馴化已適應(yīng)在CEF細(xì)胞上生長的HQ株細(xì)胞毒與其它法氏囊病毒不同，不易適應(yīng)在Vero細(xì)胞上繁殖.

表1 IBDV HQ株在DF-1及CEF上不同代次的毒價Table 1 The virus titer of different generation of IBDV HQ strain on DF-1 and CEF

2.2 方瓶中IBDV的最佳接毒量及最佳收毒時間的確定

用T25方瓶36個，分成3組，分別按0.5%，1%，2%接毒量接入，接毒后不同時間測定毒價.由表2可知，在這3種不同的接毒量下，IBDV均可在DF-1細(xì)胞上增殖，但1%接毒量組最好，最高毒價可達(dá)到8.5 mL－1，最高毒價出現(xiàn)在接毒后36 h左右，其余時間毒價也都能維持在8.0 mL－1以上;0.5%接毒量組毒價最高在8.3 mL－1，出現(xiàn)在接毒后36 h，而2%接毒量組只有在24 h時毒價達(dá)到8.0 mL－1，以后都逐漸下降.根據(jù)以上結(jié)果，在方瓶DF-1細(xì)胞上培養(yǎng)法氏囊HQ株時最佳的接毒量為1%(毒價為8.0 mL－1)，最佳的收毒時間應(yīng)在接毒后36 h，此時細(xì)胞病變最明顯(病變達(dá)80%以上).因接毒時細(xì)胞長成單層，經(jīng)計(jì)數(shù)為7×106個，故計(jì)算最佳 MOI約為0.7(TCID50·細(xì)胞－1).

表2 不同接毒量及收毒時間病毒毒價Table 2 The optimized inoculation dose and time of harvest virus

2.3 IBDV HQ株增殖時培養(yǎng)液最佳 pH值的確定

從表3中可見，pH值為7.0時，最適合IBDV的增殖，病毒毒價最高，達(dá)8.5 mL－1左右，維持時間也較長，從36～48 h都處在高峰期;在pH值為6.6的偏酸性環(huán)境中培養(yǎng)時，病毒增殖稍受影響，最高毒價也達(dá) 8.5 mL－1，但維持時間較短;而在pH值為7.6的偏堿性環(huán)境培養(yǎng)時不利于病毒增殖，病毒最高毒價僅8.3 mL－1，出現(xiàn)在接毒后24 h瞬間，以后逐漸下降.

表3 不同pH值時IBDV增殖的毒價Table 3 The titers of IBDV propagated in different pH

2.4 不同接毒時間對IBDV增殖的影響

細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果(表4)可以看出，在細(xì)胞傳代第1天后細(xì)胞的數(shù)量迅速增加，在第3天時細(xì)胞的生長密度最大，達(dá)到9.8×106個.從表4中可以看出在細(xì)胞迅速增長的第2天時接毒效果最好，接毒后24～36 h收獲(細(xì)胞病變80%以上)，毒價可以達(dá)到8.5 mL－1.第3 天接毒毒價也可達(dá)8.5 mL－1，但維持時間較短.第1和第4天接毒效果不如第1和第2天的好，第1天接毒又比第4天略高.可見IBDV增殖的效果直接與接毒時的細(xì)胞狀態(tài)和數(shù)量有關(guān)，處在對數(shù)生長期的細(xì)胞數(shù)量愈大，病毒繁殖的滴度愈高，反之則愈低.

2.5 維持液中血清濃度對IBDV增殖的影響

用48個T25方瓶分成4組，研究維持液中不同血清濃度對IBDV增殖的影響，從表5可以看出，用體積分?jǐn)?shù)2%血清含量的維持液培養(yǎng)時，對病毒的增殖最為有利，病毒的毒價最高，可達(dá)8.5 mL－1;用無血清的維持液培養(yǎng)IBDV次之，無血清的培養(yǎng)基條件下，病毒可以繁殖，但毒價并不高;在5%和8%的高血清含量下，病毒的增殖受到影響，因而均沒有在使用體積分?jǐn)?shù)2%血清含量時的毒價高.

表4 不同接毒時間IBDV增殖的毒價Table 4 The titers of IBDV at different inoculation time

表5 不同血清濃度時IBDV增殖的毒價Table 5 The titers of IBDVwith different serum concentration

2.6 IBDV HQ株在方瓶DF-1細(xì)胞上的繁殖動態(tài)及上清液與細(xì)胞全懸液毒價之間的關(guān)系

從圖1中可以看出，接毒6 h后上清液與全懸液毒價均呈上升趨勢，但在24 h之前上清的毒價略低于細(xì)胞全懸液的毒價約0.5個滴度，而在24～36 h之間，它們之間的毒價相同，且維持在同一高峰8.5 mL－1左右.此時收獲毒價最高，通常是凍融后取細(xì)胞全懸液，或不凍融，直接收取上清毒液.之后在42～66 h之間，上清與全懸液的毒均呈下降趨勢，二者高低無明顯規(guī)律.

2.7 IBDV HQ株病毒增殖時的糖耗動態(tài)

在試驗(yàn)2.6中取樣測定病毒液毒價的同時，測定其上清液中的殘?zhí)橇浚悦? h的實(shí)際糖耗為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)繪制出病毒增殖時的糖耗曲線(黑色箭頭代表接毒的時間，圖2)，0 h代表接毒時間，0 h之前為細(xì)胞生長期，0 h之后為接毒后病毒增殖期.從圖2可以看出，接毒后12 h內(nèi)，糖耗增加緩慢，12 h后糖耗迅速增長，在18 h出現(xiàn)一個糖耗高峰，但是維持時間較短，約1～2 h，之后糖耗速下降，在24～36 h后，糖耗基本接近0.另外，細(xì)胞病變及計(jì)數(shù)結(jié)果表明，接毒前細(xì)胞計(jì)數(shù)為9.7×106，接毒后6 h時細(xì)胞無明顯病變，細(xì)胞數(shù)為1.1×107個;18 h時細(xì)胞間隙變大，部分細(xì)胞圓縮，并有許多細(xì)胞脫落死亡，細(xì)胞數(shù)為7.5×106個，24 h時細(xì)胞約有50%脫落，36 h時80%以上的細(xì)胞已經(jīng)脫落死亡，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果為2.5×106個.顯示在接毒后短時間內(nèi)細(xì)胞并沒有停止增殖，所以糖耗繼續(xù)增長，同時在病毒的剌激下耗糖劇增，但隨著病毒大量繁殖，細(xì)胞的迅速死亡，糖耗快速下降漸接近0.糖耗曲線圖與病毒增殖時的上清毒價曲線圖相比，糖耗的高峰要先于病毒毒價高峰的出現(xiàn)，而且糖耗的高峰維持時間更短，糖耗在高峰之后快速下降，當(dāng)降低到接近0時病毒的毒價最高.顯示病毒的毒價和細(xì)胞糖耗呈現(xiàn)一定的平行關(guān)系，因此在生物反應(yīng)器中可用測定糖耗來推測細(xì)胞生長情況及病毒增殖趨勢，并應(yīng)在糖耗接近0的瞬間及時收獲毒液.

圖1 方瓶中上清液與細(xì)胞懸液之間的關(guān)系Fig.1 Retationship between supernatant and cell suspension in cell bottles

圖2 病毒增殖的糖耗曲線Fig.2 The Curve of sugar consumption for virus multiplication

3 討論

Vero細(xì)胞是貼壁依賴性細(xì)胞，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疫苗生產(chǎn).許多學(xué)者報道IBDV可在Vero細(xì)胞上繁殖，用來生產(chǎn)疫苗.李有根等［4］對IBDV BJ83株在Vero細(xì)胞上進(jìn)行了適應(yīng)，證明IBDV BJ83株在Vero細(xì)胞上有很好的增殖能力，且病毒滴度與細(xì)胞的培養(yǎng)代次有關(guān).顧銘等［5］研究發(fā)現(xiàn)，法氏囊弱毒株能在Vero細(xì)胞上適應(yīng)和增殖，而且病毒滴度有了很大的提高.但是，本試驗(yàn)將IBDV HQ株細(xì)胞毒在Vero細(xì)胞連傳5代，沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，表明經(jīng)過培育、馴化的細(xì)胞適應(yīng)毒IBDV HQ株暫時不能適應(yīng)在Vero細(xì)胞上生長，但是在同源DF-1細(xì)胞系上第1代就能適應(yīng)，之后幾代表現(xiàn)出很強(qiáng)的適應(yīng)和繁殖能力.與CEF相比，DF-1細(xì)胞更適合IBDV HQ株的繁殖，接毒后病變出現(xiàn)較快，病毒繁殖的滴度更高，這與 WANG YONGQIANG等［6］用熒光定量PCR的方法研究IBDV在CEF和DF-1細(xì)胞上增殖的結(jié)果一致.本試驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過培養(yǎng)條件的優(yōu)化，IBDV HQ株在DF-1細(xì)胞上的毒價可達(dá)到8.5 mL－1以上，是在雞胚成纖維細(xì)胞上毒價的10倍.

試驗(yàn)表明，要獲得高毒價的病毒液，關(guān)鍵因素之一是最佳接毒時間、最佳接毒量(MOI)和最佳的收毒時間.本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在細(xì)胞生長到第2天長成單層時，細(xì)胞數(shù)量，接毒最好.接毒量不是越大越好，而接毒量小，病毒達(dá)到高毒價的時間延長，有時不出現(xiàn)最高毒價;接毒量大，病變出現(xiàn)得快，但毒價較低.只有在最佳的接毒量時才可獲得最大的細(xì)胞數(shù)和最高的毒價.因接毒時種毒的毒價和細(xì)胞的總數(shù)都是變數(shù)，所以最佳接毒量應(yīng)該用每個細(xì)胞的病毒感染量來表示，即用MOI來表示更為科學(xué).經(jīng)測定方瓶中的最佳接毒量為1%(MOI為0.7 TCID50·細(xì)胞－1).

病毒在細(xì)胞上的增殖曲線和糖耗曲線動態(tài)表明，在病毒增殖早期，病毒在細(xì)胞全懸液中的毒價要比上清液中的毒價略高，當(dāng)病毒增殖到最高毒價時，病毒上清液和細(xì)胞懸液之間的毒價基本相同，二者有明顯的平行關(guān)系.因此，我們可根據(jù)上清的毒價測定來推斷細(xì)胞全懸液中的真正毒價.另外，從病毒增殖時細(xì)胞的糖耗曲線可看出細(xì)胞糖耗高峰要比病毒最高毒價出現(xiàn)的時間提前，說明在病毒的剌激下細(xì)胞的代謝活動旺盛，隨后細(xì)胞在病毒的作用下不斷死亡，糖耗也快速下降.李平忠等［7］在研究狂犬病毒接種Vero細(xì)胞時，細(xì)胞在接毒后還有一個增殖的過程，之后細(xì)胞才慢慢死亡，和本文結(jié)果相似.在細(xì)胞糖耗下降接近于零時，大部分細(xì)胞的生命活動已經(jīng)停止，此時病毒已不再增殖，但病毒的毒價最高.因病毒毒價在高峰過后下降很快，所以把握合適的收毒時間至關(guān)重要.通常在糖耗下降至接近0的瞬間收獲病毒液最好.這為IBDV HQ株在轉(zhuǎn)瓶和在生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)病毒提供了參考依據(jù).

石崗等［8］在研究IBDV于Vero細(xì)胞上繁殖時得出pH中性條件下最適合IBDV的增殖的結(jié)論;顧銘［5］等在研究時也發(fā)現(xiàn)了同樣的情況，他們推測是維持液的酸堿度對細(xì)胞活性及病毒本身雙重作用的結(jié)果，IBDV對堿性環(huán)境的耐受程度不如在酸性環(huán)境下［9］.本研究的結(jié)論表明，pH值為7.6的堿性環(huán)境下和pH值為6.6的酸性環(huán)境下病毒的毒價都低于pH值為7.0的中性環(huán)境，尤其是堿性環(huán)境對病毒繁殖影響最大，因此保持中性環(huán)境(如反應(yīng)器中自動調(diào)控pH十分重要)對細(xì)胞的生長和病毒的繁殖都很有利，是獲得最高病毒繁殖滴度的重要條件.

血清濃度的比較試驗(yàn)表明，用體積分?jǐn)?shù)2%血清含量的維持液對細(xì)胞生長最為有利，獲得的毒價也最高，與石崗等［8］的研究結(jié)果相一致.于大海等［10］研究發(fā)現(xiàn)，血清影響病毒增殖可能的原因是血清掩蔽了病毒與細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致病毒與細(xì)胞結(jié)合受阻.因此，選擇體積分?jǐn)?shù)2%的血清濃度，既可降低成本，減少血清雜蛋白對病毒繁殖的影響，利于病毒毒價的提高，又可保證細(xì)胞生長繁殖所需的營養(yǎng).

本研究對IBDV HQ株在DF-1細(xì)胞上最佳培養(yǎng)條件的研究表明:在方瓶中處在對數(shù)生長期的細(xì)胞數(shù)量接近最大時接毒最好;病毒的最佳接毒量為1%(8.0 mL－1)，MOI為 0.7(TCID50·細(xì)胞－1);最佳收毒時間為接毒后36 h左右;病毒培養(yǎng)時的最佳pH值為7.0，最佳的培養(yǎng)基是DMEM/F12，生長液的血清含量為10%，維持液的血清含量為2%.這些優(yōu)化的條件不僅能提供高毒價的病毒培養(yǎng)液，制備出高質(zhì)量的滅活疫苗用于生產(chǎn)實(shí)踐，而且能為下一步利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)IBDV提供參考依據(jù).

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