李瑞芳，田泱源，張慧茹，邱涵景，王 炳，裴昭君

(河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

應(yīng)用微生物次生代謝物防治植物病害是目前生物防治的一種主要方法.拮抗細(xì)菌由于培養(yǎng)周期短，生產(chǎn)方便，且對人畜無害、不污染環(huán)境，日益顯示出其作為生防菌工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢［1］.芽孢桿菌由于具有耐熱、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，在生物防制殺菌劑中占主導(dǎo)地位［2］.枯草芽孢桿菌BS501a是本實(shí)驗(yàn)室從水稻田里分離、篩選和鑒定的優(yōu)良拮抗菌株［3］，具有較強(qiáng)的抗稻瘟病菌活性.本試驗(yàn)對枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液的抗菌譜進(jìn)行測定，并研究其對稻瘟病的溫室防治效果，對其發(fā)酵產(chǎn)物的生物安全性和理化穩(wěn)定性進(jìn)行研究，旨在為將其開發(fā)成生物農(nóng)藥并應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

測定抗菌譜用稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)為浙江大學(xué)梁慎博士惠贈;黃瓜枯萎病菌(Fusarium spp.)、黃瓜灰霉菌(Botrytis cinerea)、玉米青枯菌(Fusarium graminearum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)、小麥根腐菌(Bipolaris sorokiniana)、小麥赤霉菌(Fusarium graminearum)、禾腐霉菌(Pythium graminicola)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)汪敏教授惠贈;辣椒枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、蘋果輪紋病菌(Botryosphaeria berengeriana f.sp.piricola)、蘋果腐爛病菌(Cytospora sp.)，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉玉霞博士惠贈;小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)由河南工業(yè)大學(xué)伊艷杰博士惠贈.

溫室防效試驗(yàn)用水稻為鄭稻18，購于河南省農(nóng)科院.

生物安全性測定用實(shí)驗(yàn)動物為KM小鼠，體重18～21 g，購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心.

1.2 培養(yǎng)基

制備枯草芽孢桿菌種子液用LB培養(yǎng)基［4］.培養(yǎng)真菌用PDA培養(yǎng)基［5］.抗菌譜測定用PD培養(yǎng)液.發(fā)酵培養(yǎng)基配方見參考文獻(xiàn)［6］.

1.3 枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液的制備

挑取新鮮培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌BS501a單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃，220 r·min－1振蕩培養(yǎng)過夜.過夜培養(yǎng)物按5%接種量接種到盛有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37℃，220 r·min－1振蕩培養(yǎng) 48 h 后得發(fā)酵液，12 000 r·min－1離心15 min，收集上清液.

1.4 枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液抗菌譜的測定

采用搖甁培養(yǎng)菌絲生長抑制法［7］測定2倍稀釋的BS501a發(fā)酵液對15株病原菌的拮抗活性.

將直徑6 mm的病原菌菌絲餅接種到20 mL發(fā)酵上清液和PD培養(yǎng)基(體積比1∶1)的混合液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素 100 μg·mL－1，抑制枯草芽孢桿菌BS501a的生長)中，28℃，140 r·min－1振蕩培養(yǎng)7 d.取出病原菌菌絲塊，用6層紗布過濾，用蒸餾水洗滌2次，轉(zhuǎn)移到玻璃平皿內(nèi)，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，每隔幾小時(shí)用刀片松動菌絲塊，避免菌絲塊與玻璃粘緊，烘至恒重，取出刮凈，轉(zhuǎn)移到盡量小的硫酸紙上，用精密電子天平稱量菌絲塊干重.每處理進(jìn)行3次重復(fù).根據(jù)公式計(jì)算菌絲生長抑制率.

菌絲生長抑制率(%)=(對照組菌絲塊重量－處理組菌絲塊重量)/對照組菌絲塊重量×100

1.5 稻瘟病溫室防效

1.5.1 稻瘟病菌孢子懸液制備 制備Ф6 mm稻瘟病菌菌餅，挑取2個(gè)放入含有1 mL無菌水的1.5 mL離心管中，在漩渦混合儀上振蕩5 min，用無菌紗布過濾除掉菌餅和菌絲，得到稻瘟病菌孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子個(gè)數(shù)，并用無菌水調(diào)配孢子懸液至濃度為105個(gè)孢子·mL－1.

1.5.2 水稻溫室栽培 取少量水稻種子先用質(zhì)量濃度為2%的次氯酸鈉溶液浸泡15 min，然后用清水漂洗3～4次，采用菲律賓國際水稻研究所推薦的盆栽水稻營養(yǎng)液培養(yǎng).設(shè)試驗(yàn)組和對照組，每組3盆，每個(gè)盆里放20～30粒水稻種子，置于光照培養(yǎng)箱中，28℃光照14 h黑暗10 h交替培養(yǎng).

1.5.3 溫室防效測定 用菲律賓國際水稻研究所推薦的盆栽水稻營養(yǎng)液，將水稻培養(yǎng)3周左右，待大部分水稻長至3葉1心時(shí)，用噴壺向水稻的葉和莖噴灑稻瘟病菌孢子懸液(含0.5%吐溫80)5 mL.用黑色塑料罩罩在水稻外層，噴灑少量無菌水保持高濕，然后置于光照培養(yǎng)箱中28℃光照14 h黑暗10 h交替培養(yǎng).24 h后，用噴壺噴灑5 mL枯草芽孢桿菌 BS501a發(fā)酵上清液(含0.5%吐溫80)對水稻進(jìn)行防治.對照組用清水噴灑.染病第6天，調(diào)查水稻染病情況，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果.調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)以葉片為單位(IRRI):0級為無病;1級為葉片病斑少于5個(gè)，長度小于1 cm;3級為葉片病斑6～10個(gè)，部分病斑長度大于1 cm;5級為葉片病斑11～25個(gè)，部分病斑連成片，占葉片面積10% ～25%;7級為葉片病斑26個(gè)以上，部分病斑連成片，占葉片面積26% ～50%;9級為葉片病斑連成片，占葉片面積50%以上或全部枯死.

病情指數(shù)、防治效果計(jì)算公式如下:

1.6 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

小鼠經(jīng)口毒性試驗(yàn)按中華人民共和國藥典(2010版)［8］介紹的方法進(jìn)行.將發(fā)酵上清冷凍干燥獲得的凍干粉用生理鹽水依次稀釋到5×10－2，5 ×10－3，5 ×10－4，5 ×10－5和 5 ×10－6g·mL－15個(gè)濃度.

選取健康實(shí)驗(yàn)動物KM小白鼠36只，每只體重18～21 g，按每組雌雄各半的原則隨機(jī)分成6組，每組6只.實(shí)驗(yàn)前對小白鼠進(jìn)行7 d的喂養(yǎng)觀察，觀察期內(nèi)小白鼠自由采食、飲水、稱重.小白鼠給藥前禁食但不禁水，過夜后，稱重.應(yīng)用5×10－2，5 × 10－3，5 × 10－4，5 × 10－5和 5 × 10－6g·mL－1不同質(zhì)量濃度的藥液，對各試驗(yàn)組小鼠一次性灌胃約0.2 mL，使枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清凍干粉口服劑量分別達(dá) 500，50，5，0.5 和 0.05 mg·kg－1，對照組灌服等量的生理鹽水.

給藥后2 h進(jìn)食，連續(xù)觀察8 d.分別于給藥后第2，4，6，8天稱重.給藥第8天解剖，觀察內(nèi)臟病理變化.采用采血管頸動脈采血，析出血清，進(jìn)行肝炎、腎炎血清學(xué)指標(biāo)檢驗(yàn)，內(nèi)容包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶酶活(AST)、堿性磷酸酶酶活(ALP)、尿素氮含量(BUN)和肌酐含量(CREA)，由中國人民解放軍第一五三中心醫(yī)院完成.

1.7 理化穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.7.1 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 依據(jù)《中華人民共和國藥典(2010 版)》［8］規(guī)定，取 4 份枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液，分2組，每組2份，每份10 mL，盛放于100 mL小燒杯中，用無菌紗布封口，分別置于45和60℃恒溫水浴鍋中.分別于第5天和第10天每組各取1份終止處理，測定熱處理后的發(fā)酵上清液對稻瘟病菌的菌絲生長抑制率，每組做3次重復(fù)，并以－20℃保存的原始發(fā)酵上清液做對照.

1.7.2 酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn) 取13份發(fā)酵上清液，每份 10 mL，分13 組，用1 mol·L－1的鹽酸和1 mol·L－1的氫氧化鈉將樣品分別調(diào)成pH值1～13范圍內(nèi)的不同pH值，每組1個(gè)pH值.分別測定每組發(fā)酵上清液對稻瘟病菌的菌絲生長抑制率，每組做3次重復(fù)，并以原始發(fā)酵上清液做對照.

1.7.3 光照穩(wěn)定性試驗(yàn) 依據(jù)《中華人民共和國藥典(2010 版)》［8］規(guī)定，取 2 份枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液，每份10 mL，分別盛放于100 mL小燒杯中，用帶有若干針孔的保鮮膜封口，置于真空干燥機(jī)中，制成干粉狀.去封口膜，放在多波段光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置光照度為(4 500±500)lx，分別光照5和10 d，取光照處理過的干粉用10 mL蒸餾水溶解，測定發(fā)酵上清干粉溶液對稻瘟病菌菌絲生長抑制率，每組做3次重復(fù)，并以原始發(fā)酵上清干粉做對照.

1.7.4 蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn) 取4份發(fā)酵上清液，每份10 mL，加入蛋白酶K至終質(zhì)量濃度50 mg·L－1，55 ℃水浴，分別作用 0.5，1.0，1.5，2.0 h，測定處理后的發(fā)酵上清液對稻瘟病菌的菌絲生長抑制率，每組做3次重復(fù)，并以原始發(fā)酵上清做對照.

1.8 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將枯草芽孢桿菌BS501a在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，生長12 h后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到新鮮的LB平板上，為第2代，以此類推，轉(zhuǎn)接10代.取第3，5，7，10代的單菌落制備種子液，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵 48 h，10 000 r·min－1離心 15 min，收集發(fā)酵上清液，分別測定其對稻瘟病菌菌絲生長抑制率，每組做3次重復(fù)，并以原始發(fā)酵上清做對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液抗菌譜的測定

按照1.4的方法，計(jì)算枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液對15種常見植物病原真菌的菌絲生長抑制率.將3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果如表1所示.

表1 枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清對植物病原真菌的菌絲生長抑制率Table 1 Mycelium growth inhibition rates of B.subtilis BS501a fermentation supernatant to plant pathogenic fungi

以85%和60%為分界點(diǎn)，菌絲生長抑制率大于85%為抑制效果強(qiáng)，菌絲生長抑制率在60%到85%之間為抑制效果中等，小于60%為抑制效果弱.菌絲生長抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌BS501a對玉米小斑病菌、小麥赤霉病菌、禾腐霉菌、稻瘟病菌、小麥根腐病菌、蘋果腐爛病菌、辣椒枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、蘋果輪紋病菌、玉米串珠鐮孢菌的抑制效果強(qiáng);對番茄早疫病菌、黃瓜鐮刀菌、小麥紋枯病菌的抑制效果中等;對黃瓜灰霉病菌和玉米青枯病菌的抑制效果弱.

2.2 溫室防效

以稻瘟病為例，進(jìn)行溫室防效試驗(yàn).具體病情指數(shù)及防治效果見表2.由結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清在溫室培養(yǎng)條件下對稻瘟病菌具有良好的防治效果，平均防治效果為64.42%.

表2 枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清對稻瘟病的防治效果Table 2 Control efficiency of B.subtilis BS501a fermentation supernatant to rice blast

2.3 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 小鼠解剖變化 小鼠經(jīng)口投胃給藥8 d后，解剖觀察，試驗(yàn)組小鼠腸系膜清亮透明，沒有出血點(diǎn).肺呈粉紅色，無出血點(diǎn).4葉肝臟大小、顏色正常，沒有變硬、變脆及腫脹現(xiàn)象，沒有出血點(diǎn).脾臟、腎臟顏色和大小均正常，無出血點(diǎn)和壞死點(diǎn)，不腫脹.胃飽滿，胃壁完整，無出血點(diǎn).胃黏膜無出血點(diǎn).心臟大小、顏色正常，無出血點(diǎn).試驗(yàn)最大劑量組與對照組無明顯區(qū)別.結(jié)果表明，KM小鼠服用枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清凍干粉500 mg·kg－1以內(nèi)劑量，8 d后，內(nèi)臟組織無病理變化.

2.3.2 小鼠血清學(xué)變化 測定小鼠血清中的肝炎、腎炎指標(biāo) ALT，AST，ALP，BUN 和 CREA，結(jié)果如表3 所示.各試驗(yàn)組 ALT，AST，ALP，BUN，CREA的平均含量與對照組的平均含量比較，沒有顯著差異，說明枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液對小鼠血清中衡量肝炎和腎炎的血清學(xué)指標(biāo)無明顯影響.由此可知，枯草芽孢桿菌 BS501a發(fā)酵液 LD50＞500 mg·kg－1，說明 BS501a發(fā)酵上清屬于低毒級，對生物是安全的.

表3 KM小鼠血清學(xué)變化Table 3 Serological changes of KM mice

2.3.3 發(fā)酵液對小鼠體重的影響 分別稱量小鼠灌胃給藥前空腹時(shí)的體重和灌胃后第2，4，6，8天的體重，結(jié)果如表4所示.由表4可知，實(shí)驗(yàn)前各組實(shí)驗(yàn)動物體重間差別不明顯，說明各組動物具有可比性.試驗(yàn)后期，最大劑量組與對照組之間體重差別仍不明顯.試驗(yàn)組小鼠在給藥期間增重變化與對照組差別不大，說明枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清對小鼠的生長沒有明顯影響.

表4 KM小鼠體重變化Table 4 Weight changes of KM mice g

2.4 理化穩(wěn)定性結(jié)果

2.4.1 熱穩(wěn)定性 枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清熱穩(wěn)定性結(jié)果如表5所示.由結(jié)果可知，發(fā)酵上清在45℃下水浴10 d，其菌絲生長抑制率僅下降2.33%，變化較小.在60℃條件下水浴，第5天時(shí)發(fā)酵液的菌絲生長抑制率下降6.73%，但是第10天其抑制率就下降了27.47%，拮抗活性變化較大.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BS501a發(fā)酵上清液在60℃下不能長久保存，在低于45℃條件下可以長時(shí)間存放.

表5 熱處理對枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液拮抗穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of heat on antagonistic stability of B.subtilis BS501a fermentation supernatant

2.4.2 酸堿穩(wěn)定性 枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液酸堿穩(wěn)定性結(jié)果見圖1.枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液自然條件下pH值為8.25，當(dāng)用HCl將發(fā)酵液的pH值調(diào)制為6時(shí)，溶液中開始出現(xiàn)沉淀，上清液拮抗活性也逐漸降低.pH值越低，沉淀越多，上清液拮抗活性也越低.pH調(diào)到2時(shí)，發(fā)酵上清液拮抗活性下降57.2%.用pH值為7.0的80%甲醇重溶沉淀，溶液拮抗活性僅為32.5%.由此可知，發(fā)酵上清液中拮抗活性物質(zhì)在酸性條件下形成了不溶性沉淀，用pH值為7.0的甲醇重溶，僅部分沉淀恢復(fù)活性.提高發(fā)酵上清液pH時(shí)，上清液始終保持澄清.當(dāng)pH＞9時(shí)，發(fā)酵上清液拮抗活性隨pH值的升高而降低，可能是發(fā)酵上清液中活性拮抗物質(zhì)在堿性條件下分解或滅活所致.結(jié)果表明，發(fā)酵上清液中的拮抗活性物質(zhì)在pH值為7～9條件下較為穩(wěn)定，活性較高.

圖1 酸堿處理對枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵液上清液拮抗穩(wěn)定性影響Fig.1 Effect of acid and alkali on antagonistic stability of B.subtilis BS501a fermentation supernatant

2.4.3 光照穩(wěn)定性 枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液光照穩(wěn)定性結(jié)果見表6.由表 6可知，BS501a發(fā)酵上清液在光照度(4 500±500)lx下照射10 d后，菌絲生長抑制率僅下降0.73%，拮抗活性比較穩(wěn)定.

表6 光照對枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液穩(wěn)定性的影響Table 6 Effect of illumination on antagonistic stability of B.subtilis BS501a fermentation supernatant

2.4.4 蛋白酶穩(wěn)定性 枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液蛋白酶穩(wěn)定性結(jié)果見表7.由表7可知，經(jīng)過蛋白酶K的作用，發(fā)酵上清液對稻瘟病菌的菌絲生長抑制率變化不大，穩(wěn)定性良好.蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，可以切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，是一種廣譜的蛋白酶.試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵上清液中起拮抗作用的主要成分不能被蛋白酶K降解.

表7 蛋白酶K對枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液拮抗穩(wěn)定性的影響Table 7 Effect of proteinase K on antagonistic stability of B.subtilis BS501a fermentation supernatant

2.5 遺傳穩(wěn)定性

枯草芽孢桿菌BS501a遺傳穩(wěn)定性結(jié)果見表8.由結(jié)果可以看出，枯草芽孢桿菌BS501a在傳了10代之后，菌絲生長抑制率僅下降0.3%，拮抗活性穩(wěn)定.

3 討論

枯草芽孢桿菌是多種植物病原菌的競爭性抑制菌，它通過競爭性生長繁殖占據(jù)生存空間的方式來阻止植物病原菌的生長.穆常青等［7］分離的枯草芽孢桿菌B2332菌株培養(yǎng)物對稻瘟病的盆栽活體防治效果為52.80%.陳雪麗等［9］分離的枯草芽孢桿菌BRF22代謝產(chǎn)物對番茄枯萎病菌菌絲生長抑制率為60%，對番茄枯萎病的溫室防治效果為44.73%.韓玲等［10］分離的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液對百合枯萎病的發(fā)病抑制率達(dá)65.3%.本研究表明，枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液對稻瘟病菌菌絲生長抑制率為91.5%，對稻瘟病的溫室生物防治效果為63.8%.因此，枯草芽孢桿菌BS501a是一株高效生防菌.在抗菌譜研究方面，選擇了多種常見的危害比較嚴(yán)重的植物病原真菌，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液對其均有很強(qiáng)的抑制作用.枯草芽孢桿菌BS501a發(fā)酵上清液對實(shí)驗(yàn)小鼠安全性好.在理化性質(zhì)研究方面，我們選擇了影響生防制劑生物穩(wěn)定性的幾個(gè)關(guān)鍵因素，如環(huán)境溫度、pH、光照、蛋白酶等，發(fā)現(xiàn)BS501a發(fā)酵液對外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，BS501a遺傳性能穩(wěn)定，適合做生防制劑.枯草芽孢桿菌BS501a的廣譜高效、安全、對外界環(huán)境的穩(wěn)定性和遺傳穩(wěn)定性，為其開發(fā)提供了理論依據(jù).枯草芽孢桿菌BS501a具有開發(fā)潛力.

表8 枯草芽孢桿菌BS501a遺傳穩(wěn)定性Table 8 Genetic stability of B.subtilis BS501a

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