孫克寧，林 峰，朱化彬，郝海生，杜衛(wèi)華，趙學(xué)明，劉 巖，秦 彤，王 棟

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

源于HIV-1前病毒(HIV-1 provirus)基因組的慢病毒載體，可以高效整合到宿主細(xì)胞基因組中，是一種高效轉(zhuǎn)基因載體，可以感染干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞類型［1，2］，已成功應(yīng)用于小鼠、牛、豬等動物研究中［3，4］.經(jīng)過研究，已經(jīng)產(chǎn)生了三質(zhì)粒和四質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)基因載體［5，6］.然而關(guān)于慢病毒的高效包裝還仍然是慢病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的一個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié).慢病毒的包裝一般采用脂質(zhì)體法和磷酸鈣法.雖然脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法具有較好的包裝效果，但脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染試劑昂貴，而磷酸鈣法則價(jià)格低廉，所以應(yīng)用較為普遍［7］.然而，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法受到很多因素影響，試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，又成為該法的一大缺點(diǎn)［8］.關(guān)于質(zhì)粒用量及各質(zhì)粒比例的研究結(jié)果表明，在最佳用量基礎(chǔ)上質(zhì)粒比例的優(yōu)化結(jié)果收效甚微，包裝效果并沒有因此而得到明顯改善［9］.病毒包裝是一個病毒載體與包裝細(xì)胞間的相互作用過程，作為相互作用的2個重要方面，細(xì)胞的不同生長和存在狀態(tài)會實(shí)時地、漸進(jìn)性地影響到兩者間的相互關(guān)系.因此，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的存在狀態(tài)是影響病毒包裝效果的最主要因素，而這種關(guān)系有可能會對轉(zhuǎn)染效果產(chǎn)生較大影響.本試驗(yàn)比較了轉(zhuǎn)染貼壁和懸浮狀態(tài)的293T細(xì)胞包裝慢病毒的效率，以期為相關(guān)研究提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

包裝質(zhì)粒psPAX2(Addgene plasmid 12260)、包膜質(zhì)粒 pMD2.G(Addgene plasmid 12259)、載體質(zhì)粒 pWPXL(Addgene plasmid 12257)購自 Addgene公司;磷酸鈣法轉(zhuǎn)染試劑:CaCl2·2H2O，NaCl，Na2HPO4等均購自Sigma公司;293T細(xì)胞系于液氮中冷凍保存;細(xì)胞培養(yǎng)液:DMEM，F(xiàn)BS，雙抗等均購自GIBCO公司;質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司;DNA marker購自天根生物技術(shù)公司.

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的制備 按照OMEGA公司提供的Endo-free Plasmid Mini Kit使用說明書進(jìn)行質(zhì)粒提取操作.提取后質(zhì)粒采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測.3個質(zhì)粒上樣量均為1 μL，天根的1 kb DNA Ladder上樣量為6 μL.用 FluorChem軟件分析電泳結(jié)果，并計(jì)算質(zhì)粒DNA的濃度.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 293T細(xì)胞培養(yǎng)液以DMEM為基本培養(yǎng)液，再添加10%FBS和1%雙抗.在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.3 轉(zhuǎn)染試劑的配置 在1個2 mL離心管中混合如下已經(jīng)配置好的試劑(50 μL 2.5 mol·L－1的 CaCl2·2H2O，10 μg psPAX2，3 μg pMD2.G，12 μg pWPXL，加無菌水補(bǔ)充體積至500 μL)用移液槍吸打混勻.在另1個2 mL離心管中加入500 μL 2×HEPES，將上述質(zhì)粒與CaCl2·2H2O混合液用移液槍逐滴滴加到2×HEPES溶液中，邊滴加邊使用另一把移液槍吸打混勻，之后室溫下靜置10 min，準(zhǔn)備進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染.

1.2.4 轉(zhuǎn)染貼壁狀態(tài)的293T細(xì)胞 293T細(xì)胞消化后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定其密度.分別取0.5×106，1×106個細(xì)胞移植到6孔板中，再補(bǔ)加完全培養(yǎng)基到2 mL，培養(yǎng)23 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染時取1.2.3配置的轉(zhuǎn)染試劑200 μL分別滴加到6孔板的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，并晃動6孔板使之混勻，然后將6孔板放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后換液并繼續(xù)培養(yǎng).

1.2.5 轉(zhuǎn)染懸浮狀態(tài)的293T細(xì)胞 293T細(xì)胞消化后，分別取1×106，2×106，3×106個細(xì)胞移植到6孔板中，再補(bǔ)加完全培養(yǎng)基到2 mL，立刻進(jìn)行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染時取上述轉(zhuǎn)染試劑200 μL分別滴加到6孔板的懸浮細(xì)胞中，用1 mL移液槍輕輕吸打細(xì)胞培養(yǎng)基使之混勻.然后將6孔板放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后換液并繼續(xù)培養(yǎng).

1.2.6 Lasrt法測定病毒滴度 上述2種轉(zhuǎn)染方法，均于轉(zhuǎn)染后48 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果.取轉(zhuǎn)染效果較好的3組，A組:移植數(shù)量為0.5×106個貼壁細(xì)胞組;B組:1×106個懸浮細(xì)胞組;C組:2×106個懸浮細(xì)胞組.每組設(shè)3個重復(fù)，分別于轉(zhuǎn)染48 h后收集病毒上清液.每個重復(fù)取病毒液10 μL檢測病毒滴度，其余包裝好的病毒液全部凍存于－80℃.

293T細(xì)胞于消化后以2×104個每孔接種到96孔板，每孔補(bǔ)加完全培養(yǎng)基至100 μL，每8個孔為1個組，共9組.培養(yǎng)24 h后用移液槍吸棄舊的培養(yǎng)基，每孔加90 μL新的培養(yǎng)基.第1個孔加10 μL病毒液，用移液槍輕輕吸打8～10次混勻.從第1個孔取10 μL混合液加到第2個孔，混勻.這樣以后每孔依次稀釋10倍.最后放到培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后換液，之后每隔24 h換液1次.感染后72 h在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光表達(dá)情況.按照江千里等［10］的方法確定計(jì)量孔(設(shè)為第n個孔)，并數(shù)出計(jì)量孔中陽性細(xì)胞的數(shù)量(設(shè)為m個，)，如果有2個以上的陽性細(xì)胞緊挨著，算作1個細(xì)胞.則病毒滴度為m×10n+1TU·mL－1.

1.2.7 轉(zhuǎn)染結(jié)果的觀測 由于載體質(zhì)粒pWPXL中帶有綠色熒光蛋白基因，所以使用熒光倒置顯微鏡，在藍(lán)光的激發(fā)下可以使表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，便于觀察轉(zhuǎn)染效果.

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對數(shù)據(jù)進(jìn)行了方差分析和多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 慢病毒質(zhì)粒的制備

提取3個質(zhì)粒后電泳(圖1)，泳道1為質(zhì)粒pWPXL(10.5 kb)，質(zhì)量濃度為 1.32 g·L－1.泳道2 為質(zhì)粒 psPAX2(10.7 kb)，質(zhì)量濃度為 1.13 g·L－1.泳道3 為質(zhì)粒 pMD2.G(5.8 kb)，質(zhì)量濃度為0.49 g·L－1.質(zhì)粒的質(zhì)量濃度都大于 0.025 g·L－1［11］，介于前人同類研究結(jié)果之間［7］，符合慢病毒包裝的要求.

圖1 3個質(zhì)粒的電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis result of three plasmids

2.2 293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果

轉(zhuǎn)染48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果(圖2).轉(zhuǎn)染結(jié)果表明，貼壁狀態(tài)下細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效果影響很大.細(xì)胞數(shù)量為1×106組，轉(zhuǎn)染時貼壁細(xì)胞已經(jīng)快長滿，轉(zhuǎn)染效果很差.細(xì)胞數(shù)量為0.5×106組，轉(zhuǎn)染時貼壁細(xì)胞生長至50% ～70%，轉(zhuǎn)染后熒光強(qiáng)度強(qiáng)于前者，陽性細(xì)胞數(shù)量也明顯多于前者.

懸浮狀態(tài)293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖3.移植細(xì)胞數(shù)量為1×106，2×106組，轉(zhuǎn)染效果都比較好.當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加到3×106時，轉(zhuǎn)染效果明顯變差.推測，當(dāng)移植細(xì)胞數(shù)量增加到3×106時，由于細(xì)胞數(shù)量過多，細(xì)胞的代謝廢物短時間內(nèi)迅速積累，使培養(yǎng)液顏色迅速變黃，培養(yǎng)液pH值迅速減小.換液時pH值已經(jīng)減小到6.28，而細(xì)胞數(shù)目為1 ×106和2 ×106組的 pH 值分別為7.41，7.01.研究表明，磷酸鈣轉(zhuǎn)染的最適 pH值在 6.96～7.60［8］，3 ×106組培養(yǎng)基的 pH 值遠(yuǎn)超過了最適的轉(zhuǎn)染范圍.

從圖3－B和圖2－D可以看出，2種狀態(tài)下的轉(zhuǎn)染對細(xì)胞造成了不同影響.圖2－D中轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞貼壁比較牢，細(xì)胞緊密地連接成片貼在培養(yǎng)皿底面.而圖3－B中轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞聚集成堆，輕輕地貼在培養(yǎng)皿底面.這可能是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染時，由于懸浮細(xì)胞大量吞入磷酸鈣沉淀，使得細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重，使細(xì)胞聚集成團(tuán)、貼壁性變差.

圖2 貼壁狀態(tài)下293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h的慢病毒包裝效果Fig.2 Typical results of lentivirus packaging using adherent 293T cells at 48 h after transfection

2.3 慢病毒滴度檢測

采用Lasrt法的病毒滴度測定結(jié)果如表1.對3組數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果表明，3個轉(zhuǎn)染組病毒滴度差異極顯著(P＜0.01).多重比較分析結(jié)果，C組病毒包轉(zhuǎn)效果極顯著(P＜0.01)高于A組和B組，而A組和B組間差異不顯著(P＞0.05).

表1 慢病毒滴度的測定結(jié)果Table 1 Determinated results of lentivirus titration

圖3 懸浮狀態(tài)下293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h的慢病毒包裝效果Fig.3 Typical results of lentivirus packaging using suspended 293T cells at 48 h after transfection

3 結(jié)論與討論

1)以往應(yīng)用磷酸鈣法包裝慢病毒時，都是將一定數(shù)量的293T細(xì)胞移植到培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)到細(xì)胞完全貼壁并且生長匯合至50%～70%后再進(jìn)行轉(zhuǎn)染(約24 h)［12］.這時的細(xì)胞處在旺盛的貼壁生長狀態(tài)，其活力要好于剛消化傳代的懸浮細(xì)胞，此時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，能取得較好的轉(zhuǎn)染效率［2，13］.過了這一時機(jī)，雖然能得到更多的待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但293T細(xì)胞將會受到接觸抑制，生長速度逐漸降低，卻影響到了轉(zhuǎn)染效率.本研究中圖2－C和圖2－A的比較結(jié)果也表明，生長旺盛時期會有較好的轉(zhuǎn)染效果.這表明采用貼壁狀態(tài)的293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝時，細(xì)胞密度是一個重要的限制因素.這樣就不能充分利用培養(yǎng)基所構(gòu)成的立體空間，無法通過提高細(xì)胞數(shù)量提高病毒滴度.

2)本研究采用懸浮狀態(tài)的293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，取得了很好的轉(zhuǎn)染效果.懸浮狀態(tài)下，細(xì)胞密度可以通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板得到相對精確的測定，使得轉(zhuǎn)染的重復(fù)性變得很好.并且，可充分利用培養(yǎng)基所構(gòu)成的立體空間，在一定范圍內(nèi)可以大量地增加細(xì)胞數(shù)量而不會影響轉(zhuǎn)染效果.本研究在1×106～2×106的范圍內(nèi)都得到了較為理想的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效果，最高將6孔板中每孔細(xì)胞的數(shù)量增加到2×106個而不影響轉(zhuǎn)染效率.從質(zhì)粒與靶細(xì)胞相互作用的空間來考慮，貼壁的細(xì)胞只有上表面與磷酸鈣沉淀接觸，而懸浮狀態(tài)的293T細(xì)胞整個細(xì)胞膜表面都有可能與磷酸鈣沉淀有接觸，這樣就提高了與外源DNA結(jié)合的機(jī)會，增加了轉(zhuǎn)染成功的概率以及進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒數(shù)量.另外，在懸浮細(xì)胞逐漸貼壁過程中，相鄰細(xì)胞將圍繞周圍的磷酸鈣沉淀擠壓在細(xì)胞與培養(yǎng)皿底面、細(xì)胞與細(xì)胞中間，使外源DNA與細(xì)胞的接觸更緊密.細(xì)胞與磷酸鈣沉淀的這種近距離甚至是零距離的接觸對外源DNA進(jìn)入細(xì)胞可能也有一定的推動作用.最終，通過轉(zhuǎn)染懸浮狀態(tài)的293T細(xì)胞，病毒滴度比貼壁狀態(tài)轉(zhuǎn)染時約提高 3.5 倍［1，7］.本方法可以在細(xì)胞消化后立即進(jìn)行轉(zhuǎn)染，有效地克服了包裝效果的不穩(wěn)定性，并通過提高細(xì)胞數(shù)量獲得了更高的病毒滴度，加快了研究進(jìn)程，提高了研究效率.

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