浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 胡程珩 呂 葉 李彩燕＊ 郭 宇 楊義右 黃麗萍

豆粕是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)源，價(jià)格低且來源廣，是畜牧水產(chǎn)飼料中理想的魚粉替代物。但豆粕中存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、植酸等（Francis等，2001），極大地影響了豆粕的飼用價(jià)值，需要經(jīng)過加工處理才能廣泛應(yīng)用。近年來，與加熱處理、化學(xué)浸提等常規(guī)方法相比，微生物發(fā)酵處理由于去除效果良好、營養(yǎng)價(jià)值提高、工藝環(huán)保等多種優(yōu)點(diǎn)，備受關(guān)注。以微生物發(fā)酵的方法來降低植物蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究已有不少報(bào)道 （Hong 等，2004；Egounlety 和 Aworh，2003；El-Batal和 Karem，2001）。

反芻動(dòng)物的瘤胃是一種特殊的發(fā)酵罐，其中棲息著各種微生物（細(xì)菌、真菌、原蟲等），表現(xiàn)出很強(qiáng)的降解纖維素和消除飼料毒物的作用，包括生氰糖甙、皂甙和植酸等 （趙智力和王思珍，2008）。國內(nèi)外對瘤胃微生物的研究主要來自反芻動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域，對其在蛋白質(zhì)飼料開發(fā)方面的報(bào)道很少。筆者所在的課題組前期已通過單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)室瘤胃液發(fā)酵豆粕的條件，確定了最佳發(fā)酵模式，使發(fā)酵豆粕中主要抗?fàn)I養(yǎng)因子得到有效去除（李彩燕等，2011）。

本試驗(yàn)在最適條件下用瘤胃液對豆粕進(jìn)行了發(fā)酵，測定了發(fā)酵前后豆粕的蛋白質(zhì)品質(zhì)（氨基酸含量和蛋白質(zhì)降解情況）、微生物組成（細(xì)菌總數(shù)、乳酸菌、大腸桿菌、霉菌）及pH值，以證實(shí)瘤胃液發(fā)酵豆粕的益處，可進(jìn)一步為工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵植物蛋白質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 豆粕原料與瘤胃液 豆粕原料購自寧波市鄞州區(qū)鐘公廟集貿(mào)市場。稱取同批豆粕粉碎，過40目篩，充分混勻，干燥保存?zhèn)溆?。瘤胃液取自健康瘺管湖羊瘤胃，使用前用四層紗布過濾。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （PCA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）、月桂基硫酸鹽胰蛋白質(zhì)胨（LST）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB），均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 生化培養(yǎng)箱（GZX，寧波東南儀器有限公司）、酸度計(jì) （梅特勒-托利多FE20）、微型發(fā)酵瓶（三角瓶）、凱氏定氮儀、培養(yǎng)皿、鹵素水分測定儀（MB35）、日立L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 體外發(fā)酵技術(shù) 參考Menke體外產(chǎn)氣法（Menke等，1998），利用瘤胃液中的微生物對豆粕進(jìn)行厭氧發(fā)酵處理。瘤胃液接種量為5%，料水比為 1∶1，39 ℃厭氧發(fā)酵 72 h（李彩燕等，2010）。

1.2.2 氨基酸含量的測定 發(fā)酵前后豆粕樣品經(jīng)鹽酸水解后，氨基酸含量用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行測定。

1.2.3 豆粕蛋白質(zhì)的電泳分析 參考馬文強(qiáng)等（2008）和 Hoffmann 等（2003）方法。稱取粉碎后過60目的豆粕1.00 g，加入20.00 mL 0.03 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），在室溫下于搖床上 100 r/min浸泡 1 h；然后 10000 r/min，20 ℃離心 20 min，取上清。提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.4 樣品pH值的測定 參考那淑敏等（1999）方法。豆粕發(fā)酵前后的樣品烘干處理后各稱取10 g，用 100 mL蒸餾水混合浸提2 min，經(jīng)四層紗布過濾，使用酸度計(jì)測定水溶液的pH值。

1.2.5 樣品菌群的測定 分別取發(fā)酵前后的風(fēng)干豆粕樣品1 g，加入有9 mL無菌水的試管中，渦旋器混勻，再稀釋至 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度梯度，每個(gè)梯度分別重復(fù)3次，按照以下方法進(jìn)行操作。細(xì)菌菌落總數(shù)的測定按GB/T4789.2-2008執(zhí)行；大腸菌群的測定按GB/T4789.3-2008執(zhí)行（分別采用MPN計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)法）；乳酸菌測定按GB/T4789.35-2008執(zhí)行；霉菌測定按 GB/T4789.15-2008執(zhí)行。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步處理后，采用SAS（1999）廣義線性模型（GLM）的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析法和顯著性檢驗(yàn)，平均數(shù)之間用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵前后氨基酸含量的變化 瘤胃微生物發(fā)酵前后豆粕中氨基酸含量變化見表1。由表1可知，氨基酸總量由發(fā)酵前得47.25%提高到發(fā)酵后的48.67%，比發(fā)酵前提高了3%，絕大多數(shù)氨基酸的含量都有所提高。

表1 發(fā)酵前后豆粕中氨基酸含量的變化%

2.2 發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)的電泳分析結(jié)果 對發(fā)酵前后的豆粕蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳可得到圖1的結(jié)果，可見，大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)得到降解，分子質(zhì)量大于31 kDa的蛋白質(zhì)明顯減少，小分子多肽明顯增加。

2.3 發(fā)酵前后豆粕中pH值和菌群結(jié)構(gòu)的變化瘤胃內(nèi)容物發(fā)酵對豆粕pH值和菌群結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果見表2。由表2可知，豆粕經(jīng)瘤胃內(nèi)容物發(fā)酵后pH值顯著下降，降低了1.32個(gè)單位。

細(xì)菌總數(shù)顯著增加，增加了2個(gè)數(shù)量級，霉菌和大腸桿菌均顯著降低，分別降低了3個(gè)和1個(gè)數(shù)量級。而有益的乳酸菌顯著上升，上升了4個(gè)數(shù)量級。

圖1 發(fā)酵前后豆粕中的蛋白質(zhì)電泳圖

表2 發(fā)酵前后豆粕pH值和微生物指標(biāo)測定結(jié)果

3 討論

3.1 發(fā)酵對豆粕氨基酸組成和蛋白質(zhì)肽的影響豆粕經(jīng)瘤胃內(nèi)容物發(fā)酵后，胰蛋白質(zhì)酶抑制因子和植酸等主要抗?fàn)I養(yǎng)因子含量大大降低，營養(yǎng)特性得到明顯改善（李彩燕等，2011）。本試驗(yàn)期望通過瘤胃微生物對豆粕的發(fā)酵，微生物大量繁殖，把部分原料轉(zhuǎn)化為菌體蛋白質(zhì)，改善蛋白質(zhì)氨基酸組成，還能積累一些有益代謝產(chǎn)物。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豆粕發(fā)酵后，氨基酸含量也升高，與筆者前期對營養(yǎng)特性的研究結(jié)論一致。馬文強(qiáng)等（2008）通過枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌和乳酸菌對豆粕進(jìn)行發(fā)酵后，其氨基酸的含量比發(fā)酵前提高了11.49%。同時(shí)本試驗(yàn)對發(fā)酵豆粕進(jìn)行電泳得出，發(fā)酵前大分子蛋白質(zhì)已被降解為小分子質(zhì)量的肽類，這與馬文強(qiáng)等（2008）的結(jié)果相一致。發(fā)酵后豆粕小肽含量的增加可能是由于發(fā)酵過程中微生物分泌的蛋白質(zhì)酶分解部分大分子蛋白質(zhì)得到的。蛋白質(zhì)被微生物分解后，生成動(dòng)物易吸收的小分子蛋白質(zhì)或小肽，以提高豆粕利用率與蛋白質(zhì)的吸收率（馬文強(qiáng)等，2008）。

3.2 發(fā)酵對豆粕菌群組成的影響 乳酸菌屬于有益的腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，可對動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡進(jìn)行調(diào)整，達(dá)到幫助飼料消化吸收，提高飼料利用率，抑制腸道病原菌等多方面的作用 （江萍等，1998）。豆粕經(jīng)瘤胃液作用發(fā)酵后，菌落總數(shù)和乳酸菌數(shù)量明顯增加。這與賈朋輝等（2009）微生態(tài)發(fā)酵飼料中細(xì)菌總數(shù)和乳酸菌的變化趨勢相一致，雖然采用不同的發(fā)酵菌種，本試驗(yàn)中使用瘤胃液，賈朋輝等（2009）使用乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵，但是均說明了發(fā)酵能促進(jìn)微生物的大量增殖。此外，由于微生物發(fā)酵糖類產(chǎn)酸和厭氧程度的逐漸加強(qiáng)，使物料環(huán)境更有利于乳酸菌的增殖。

僅用菌落總數(shù)不能作為評價(jià)發(fā)酵豆粕質(zhì)量好壞的指標(biāo)（劉金萍和王士長，2006），需要結(jié)合乳酸菌、大腸桿菌、霉菌等微生物指標(biāo)的變化。大腸桿菌主要來源于人畜糞便，有些是致病菌或條件致病菌，常被用來作為評價(jià)食品及飼料的衛(wèi)生質(zhì)量指標(biāo)（賈朋輝等，2009）。本試驗(yàn)中，豆粕發(fā)酵后，菌落總數(shù)和乳酸菌明顯增加的同時(shí)，大腸菌群和霉菌數(shù)量下降，表示其有害菌的數(shù)量下降。

3.3 發(fā)酵對豆粕pH值的影響 從表1可以看出，豆粕經(jīng)過瘤胃液發(fā)酵后，pH值顯著降低。可能由于發(fā)酵后，豆粕中乳酸菌大量增殖，在生長過程中同時(shí)產(chǎn)生乳酸，使飼料的pH值降低。劉金萍和王士長（2006）應(yīng)用植物乳桿菌發(fā)酵斷奶仔豬料也發(fā)現(xiàn)，飼料經(jīng)過發(fā)酵后，pH值都有所降低，最終pH值與乳酸菌含量有一定的關(guān)系。

4 小結(jié)

豆粕經(jīng)瘤胃內(nèi)容物發(fā)酵后，氨基酸含量提高，大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)得到降解，小分子多肽明顯增加，并且顯著增加了有益的乳酸菌含量，降低了有害的霉菌和大腸菌群的數(shù)量。本試驗(yàn)利用瘤胃微生物較強(qiáng)的消化去毒作用，證實(shí)了瘤胃液可作為豆粕發(fā)酵處理的有效菌源，為開辟新的植物蛋白質(zhì)飼料資源進(jìn)行了有益的探索。

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