安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 崔松松 張 ?。?何孔泉 張 潔

生姜蛋白酶是從生姜中提取出的一種植物蛋白酶，作為一種新型植物蛋白酶 （孫國梁等，2007），生姜蛋白酶食用安全，且具有藥用保健價值，可用作食品添加劑，如嫩肉劑（吳巧玲，2001）和酒澄清劑、乳制品凝固劑等（唐曉珍等，2002），其應(yīng)用前景廣泛。但是在實際應(yīng)用中，游離的生姜蛋白酶對環(huán)境敏感、穩(wěn)定性較差，易失活，反應(yīng)后難以回收（刁恩杰和丁曉雯，2003）。通過對酶的固定化制備，可提高生姜蛋白酶的穩(wěn)定性，拓展其應(yīng)用范圍。

近年來固定化酶在各學(xué)科領(lǐng)域的研究異?；钴S，并得到迅速發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。目前使用和研究中的固定化酶的方法和載體材料種類繁多，其中用海藻酸鈉固定化酶的優(yōu)點是使用方法較為簡單，反應(yīng)條件溫和，海藻酸鈉還具有無毒、不易被大多數(shù)微生物降解的優(yōu)點（魯玉俠等，2007；張富新等，2005）；但海藻酸鈣凝膠具有不穩(wěn)定、鈣離子易脫落、凝膠變軟甚至溶解等缺點，因此為了克服以上缺點（鄭婉玲等，1998），本研究選用以戊二醛為交聯(lián)劑制備海藻酸鈉固定化生姜蛋白酶 （王娜等，2009），以期來提高生姜蛋白酶的穩(wěn)定性，同時為固定化生姜蛋白酶的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及試劑 TD4低速自動平衡離心機(jī)，長沙平風(fēng)儀器儀表有限公司；LXJ-ⅡB低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；KQ-400DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FA2024A電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；752C型紫外分光光度計，南京第四分析儀器有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、酪氨酸、三氯乙酸等均為國產(chǎn)試劑。

1.2 生姜蛋白酶的制備 生姜粉碎后，加入-20℃丙酮，抽干得粉末，再加適量的pH 6.0的磷酸緩沖液提取，離心，取上清液加入單寧使其濃度達(dá)0.12%，低溫離心，取沉淀物加入緩沖液定容，既為生姜蛋白酶粗酶液（唐曉珍等，2003）。

1.3 固定化酶的制備 取1 mL的溶液酶與2 mL的海藻酸鈉于注射器內(nèi)混勻，然后用注射器將混合液滴入CaCl2溶液中硬化1 h，戊二醛溶液中交聯(lián)4 h，抽濾，所得的凝膠珠即為固定化酶。

1.4 酶活性的測定 取酶液1 mL，40℃條件下加入底物酪蛋白1 mL，混勻，反應(yīng)20 min，加入3 mL三氯乙酸終止反應(yīng)，取上清液在275 nm下測定OD值。固定化酶的酶活測定方法同上。

活力單位定義：一定條件下（pH 6.0，溫度為40℃）每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量。

1.5 固定化條件的優(yōu)化

1.5.1 海藻酸鈉濃度的影響 戊二醛濃度為1%，CaCl2的濃度為3%，配制濃度為0.5%、1%、2%和3%的海藻酸鈉溶液。制備不同濃度海藻酸鈉的固定化酶。在275 nm下做酶活測定。

1.5.2 戊二醛濃度的影響 海藻酸鈉的濃度為2%，CaCl2的濃度為2%，配制濃度為0.5%、1%、2%、3%和4%戊二醛溶液。制備固定化酶并測其酶活。

1.5.3 CaCl2濃度的影響 海藻酸鈉的濃度固定為2%，戊二醛的濃度為1%，配制濃度為1%、2%、3%、4%和5%的CaCl2溶液。制備固定化酶并測定其酶活。

1.5.4 驗證試驗 海藻酸鈉濃度為2%，戊二醛濃度為3%，CaCl2濃度為2%，制備固定化生姜蛋白酶。40℃條件下反應(yīng)20 min，275 nm下測其酶活。游離酶做同樣處理。

1.6 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

1.6.1 固定化酶和溶液酶最適溫度的測定 在優(yōu)化條件下制備固定化酶，并分別在30、40、50、60、70℃條件下進(jìn)行反應(yīng)。溶液酶做同樣處理。

1.6.2 固定化酶和溶液酶的最適pH值的測定在優(yōu)化條件下制備固定化酶，分別在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖液環(huán)境中進(jìn)行反應(yīng)。溶液酶做同樣處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度的影響 載體的濃度影響固定化酶的活性。海藻酸鈉濃度過低時載體與酶的固定不完全，易導(dǎo)致酶流失；海藻酸鈉濃度過高時海藻酸鈉的黏度過大，影響酶與底物反應(yīng)，從而影響酶活性。根據(jù)測得的結(jié)果，由圖1可知海藻酸鈉的最適濃度為2%。

2.2 戊二醛濃度的影響 戊二醛是常用的交聯(lián)劑，其濃度較低時易導(dǎo)致酶與載體脫落，進(jìn)而影響酶活性；其濃度過大時易導(dǎo)致戊二醛分子內(nèi)發(fā)生交聯(lián)而影響酶活性，合適的戊二醛的濃度對固定化酶的活性影響最小，根據(jù)圖2的結(jié)果可知，戊二醛的最適濃度為3%。

圖2 戊二醛濃度對固定化酶活性的影響

2.3 CaCl2濃度的影響 CaCl2可與海藻酸鈉反應(yīng)形成海藻酸鈣，CaCl2濃度的大小影響凝膠珠的機(jī)械強度。根據(jù)測得的結(jié)果，如圖3可知，當(dāng)CaCl2的濃度為2%時固定化酶酶活性達(dá)到最大值。

圖3 CaCl2濃度對固定化酶活性的影響

2.4 驗證試驗 在上述最優(yōu)條件下，制備固定化生姜蛋白酶，測得固定化酶的酶活為53.48 U/g。

2.5 固定化酶與溶液酶的最適溫度 由圖4可知，兩者的最適溫度均為60℃。但固定化酶的相對酶活隨著溫度的改變，變化較為平緩，在較高溫度下，在70℃時保持96.13%的相對酶活，而游離酶其酶活變化幅度較為劇烈。這是因為固定化酶包埋海藻酸鈉這一外殼后，對溫度的變化沒有游離酶敏感，表現(xiàn)出較高的溫度穩(wěn)定性。

圖4 游離酶與固定化酶的最適溫度

2.6 固定化酶與溶液酶的最適pH 圖5表明，固定化酶與溶液酶的最適pH值均為6.0。整個pH值量程中變化中，固定化酶曲線較為平緩，其相對酶活在不同pH值下仍保持80%以上，如pH值為3時固定化酶的相對酶活為80.07%，在pH值為7時酶活仍在93.4%，而游離酶的酶活隨著pH值的不同變化較大，在pH值為3時最低，其相對酶活只有37.97%，隨著pH值的升高，其酶活變化幅度劇烈，表現(xiàn)出受酸堿影響顯著，這是因為載體海藻酸鈉的性質(zhì)不僅對固定化酶的酶活有影響，而且海藻酸鈉這一外殼還起保護(hù)作用，使酸堿因素對其影響較小，顯示出比游離酶更寬泛的適應(yīng)性。

圖5 游離酶與固定化酶的最適pH

3 討論

生姜蛋白酶是一種較為新型的蛋白酶，但它的穩(wěn)定性差，并且反應(yīng)后游離酶和底物、產(chǎn)物難以分離，不利于循環(huán)使用，通過對酶固定化可以提高酶的穩(wěn)定性和利用率。但是，固定化后酶分子由游離態(tài)變成固態(tài)，由于載體的影響，酶蛋白活性構(gòu)象會發(fā)生變化，使得酶的活性中心受到限制，其次海藻酸鈉是甘露糖醛酸以β-1，4糖苷鍵相連接的多糖類物質(zhì)，雖然是較為理想的載體，并且固定化方法較為簡單，但海藻酸鈣凝膠在含多價陰離子溶液以及高濃度電解質(zhì)溶液中不穩(wěn)定、鈣離子易脫落、凝膠變軟甚至溶解，因此通過利用以戊二醛為交聯(lián)劑的海藻酸鈣固定化酶，可使固定化酶在很長一段時間內(nèi)保持活性而且能較大的提高穩(wěn)定性能（王秀征等，2009）。本研究利用海藻酸鈉和戊二醛對生姜蛋白酶進(jìn)行雙重固定，研究證實，生姜蛋白酶的固定化條件受到多個因素的影響，在海藻酸鈉的濃度為2%、戊二醛的濃度為3%、CaCl2的濃度為2%時，制備的固定化酶活力為53.48 U/g，與游離酶相比，固定化酶對溫度和酸堿顯示出更寬泛的適應(yīng)性。雖然對固定化生姜蛋白酶的研究取得一定的結(jié)果，下一步的工作仍需對固定化的其他條件、固定化酶的穩(wěn)定性等性質(zhì)做進(jìn)一步的探討，同時探索新的固定化方法，以及應(yīng)用新的載體，以提高固定化酶的活性回收率，延長其半衰期，從而達(dá)到更加理想的使用效果。

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