北京市飼料監(jiān)察所 魏秀蓮 丁美方 董穎超 楊定忠

皮革水解蛋白是利用皮革下腳料經(jīng)水解而生成的蛋白質(zhì)混合物，其主要成分為膠原蛋白。由于皮革下腳料中含有大量皮革糅制及染色過程中添加的重鉻酸鉀和重鉻酸鈉等有毒物質(zhì)，因此用這種原料生產(chǎn)水解蛋白，皮革中的重鉻酸鉀和重鉻酸鈉自然就被帶入產(chǎn)品中。如果長(zhǎng)期食用含有“皮革水解蛋白”的食物，“鉻”重金屬離子便會(huì)被人體吸收、積累、中毒，使人體關(guān)節(jié)疏松腫大，甚至造成兒童死亡。衛(wèi)生部最新引發(fā)了《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第二批）》，明令禁止在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白。皮革水解蛋白與三聚氰胺不同，是真正的蛋白質(zhì)，因此若被添加到食品中，檢測(cè)難度高于三聚氰胺。皮革水解物主要添加的食品是乳與乳制品及含乳飲料，作用是增加蛋白質(zhì)含量。由于羥脯氨酸具膠原蛋白的特有組分，其含量占膠原蛋白10%以上，而乳蛋白中不含此成分，因此通過測(cè)定樣品中的羥脯氨酸，則可以判斷樣品中是否添加了皮革水解蛋白。關(guān)于動(dòng)物組織及其他相關(guān)產(chǎn)品中羥脯氨酸的液相檢測(cè)方法已有報(bào)道（崔勇等，2008；鄭家概等，2008；孫光臣和劉英芹，2004），而關(guān)于乳及乳制品中的羥脯氨酸的檢測(cè)，尚未見報(bào)道，本文建立了測(cè)定乳與乳制品中羥脯氨酸的柱前衍生高效液相色譜法（HPLC）。

1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；氮吹儀（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

羥脯氨酸對(duì)照品、正亮氨酸對(duì)照品、異硫氰酸苯酯（天津博納艾杰爾科技有限公司）；乙腈為色譜純（美國(guó)Honeywell公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agela Venusil-AA氨基酸分析專用色譜柱 （天津博納艾杰爾科技有限公司）；流動(dòng)相A：稱取無(wú)水醋酸鈉 8.2 g，加水800 mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH至6.5，然后加水至 1000 mL，加乙腈 75 mL，混勻，用 0.45 μm 濾膜過濾；流動(dòng)相B：80%乙腈（V/V）；梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速：1 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量 50 μL。

表1 梯度洗脫程序表

2.2 溶液的配制 0.1 mol/L鹽酸溶液：量取8.3 mL濃鹽酸，加水稀釋至1000 mL。6 mol/L鹽酸溶液（含0.1%苯酚）：稱取苯0.1 g，加濃鹽酸50 mL和水50 mL溶解，混勻。12 mol/L鹽酸溶液（含0.1%苯酚）：稱取苯酚0.1 g，加濃鹽酸100 mL溶解，混勻。正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液：稱取正亮氨酸約10 mg，加0.1 mol/L鹽酸溶液 10 mL使溶解，混勻。三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混勻。異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯25 μL，加乙腈2 mL，混勻。羥脯氨酸（C5H9NO3）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 500 μg/mL:稱取 50.0 mg羥脯氨酸用0.1 mol/L鹽酸溶解并，定容至100mL容量瓶中。 標(biāo)準(zhǔn)工作液25 μg/mL:吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.00 mL置于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容至刻度，混勻，準(zhǔn)確量取1.0 mL，置1.5 mL塑料離心管，準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液 100 μL，混勻。

2.3 樣品水解 皮革蛋白粉的水解：準(zhǔn)確稱取皮革蛋白粉10～20 mg，將稱好的樣品放于10～20 mL水解管中，加入5 mL含0.1%苯酚的6 mol/L鹽酸，振搖使樣品溶解或使樣品均勻分散于溶液中，將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min（或置-20℃冰箱中冷凍），用氮?dú)庵脫Q空氣后在充氮?dú)鉅顟B(tài)下擰緊螺絲蓋，將已封口水解管放在(110±1)℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解24 h，取出冷卻。打開水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容，混勻，過濾，取濾液，作為衍生用樣品溶液。

純牛奶和皮革奶的水解：準(zhǔn)確稱取純牛奶和皮革奶約3 g，分別置于10～20 mL水解管中，每管加入3 mL濃鹽酸（含0.1%苯酚），將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min（或置-20℃冰箱中冷凍）。其余步驟同固體樣品水解過程。

2.4 樣品衍生 準(zhǔn)確量取衍生用樣品溶液1.0 mL，置玻璃管中，準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，用真空干燥器在40～50℃真空干燥或用氮吹儀吹干除去鹽酸后，加1.1 mL 0.1 mol/L鹽溶液重新溶解，混勻，量取220 μL，置1.5 mL塑料離心管中，往離心管中加入三乙胺乙腈溶液100 μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液 100 μL，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷800 μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，用 0.45 μm 小濾器過濾，取濾液適量，用水稀釋5倍后上機(jī)分析。另取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液220 μL，按上述方法衍生處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜行為及專屬性實(shí)驗(yàn) 從圖1可以看出羥脯氨酸與其他氨基酸得到很好的分離，與前后氨基酸的分離度大于8.5，表明本方法具有良好的專屬性。

3.2 線性范圍及檢測(cè)下限 精密吸取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，配制成羥脯氨酸濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.3125、0.078125 μg/mL的系列樣本， 按 2.4制備對(duì)照品溶液，并進(jìn)行色譜分析，以羥脯氨酸峰面積（Y）對(duì)濃度 （X）進(jìn)行線性回歸得Y=0.0317 X-0.5561（r＝1），以羥脯氨酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）對(duì)濃度（X）的進(jìn)行線性回歸得Y=101.87X-0.4124（r＝1），結(jié)果表明在 0.08 ～ 200 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，羥脯氨酸的濃度與峰面積間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=1。羥脯氨酸的最低檢出限為 0.014 μg/mL（S/N=3），定量限為 0.046 μg/mL（S/N=10）。

圖1 19種氨基酸高效液相色譜圖

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6.25 μg/mL的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物重復(fù)進(jìn)樣6次，保留時(shí)間及峰面積的RSD分別為0.07%和0.22%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取6.25 μg/mL的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物，按上述色譜條件分別在0、8、16、24、32、48 h測(cè)定，羥脯氨酸峰面積，內(nèi)標(biāo)物峰面積及羥脯氨酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值的RSD分別為0.43%、0.06%、0.43%，結(jié)果表明羥脯氨酸衍生物具有較好的穩(wěn)定性，至少可穩(wěn)定48 h。

3.5 回收率實(shí)驗(yàn) 分別取高 （50 μg/mL）、中（31.25 μg/mL）、低（12.5 μg/mL）三個(gè)濃度進(jìn)行空白加樣回收實(shí)驗(yàn)，回收率為98.2%～99.0%。結(jié)果見表2。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果表

3.6 樣品測(cè)定 按上述水解、衍生化及色譜條件對(duì)皮革奶，皮革水解蛋白粉和市售純牛奶進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果表

圖2 樣品高效液相色譜圖

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定乳與乳制品中皮革水解蛋白特征性成分羥脯氨酸含量的方法，高中低濃度加樣回收范圍98.2% ～99.0%。此法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確度高，樣品中各氨基酸分離度好，乳、乳制品及皮革水解蛋白粉中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)羥脯氨酸含量測(cè)定沒干擾，適用于乳及乳制品中羥脯氨酸的測(cè)定。本方法通過對(duì)羥脯氨酸含量的測(cè)定，可判定乳與乳制品制品中是否添加了皮革水解蛋白，為皮革奶檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]崔勇，劉智，張博，等.反向高效液相色譜柱前衍生化法測(cè)定保健食品中羥脯氨酸的含量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（11）：2247 ～ 2249.

[2]鄭家概，王飛，農(nóng)云軍，等.柱前衍生高效液相色譜法對(duì)動(dòng)物組織中膠原蛋白的測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（12）：1383 ～ 1385.

[3]孫廣臣，劉英芹.高壓液相色譜法測(cè)定腎臟組織羥脯氨酸含量[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2004，27（5）：79 ～ 80.