許龍巖 袁慕云 凌莉 黃華軍 鄒志飛

(廣東出入境檢驗檢疫局 廣東廣州 510623)

1 前言

經(jīng)典的副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)分離培養(yǎng)和鑒定需要1－2周時間，人力物力花費大，不適應實際檢驗工作的需要。隨著分子生物學技術的發(fā)展，分子水平上的分型與診斷方法以其敏感性高、特異性強、分型率和分辨率佳的優(yōu)點，逐漸取代了傳統(tǒng)的表型分型技術，在微生物的分型與診斷中發(fā)揮巨大的作用［1］。DiversiLab系統(tǒng)(DVL)是以基因外重復回文序列－PCR(Repetitive Extragenic Palindromic－ PCR，REP－PCR)技術為原理的自動化分子分型系統(tǒng)，已應用于原核和真核微生物的分子分型，包括具有重要流行病學意義的微生物如不動桿菌、肺炎鏈球菌、結核分枝桿菌和曲霉［2］。本研究用DVL系統(tǒng)對近幾年從食品中分離的21株VP進行REP－PCR分子分型，掌握其在食品中的分子型別，并與PFGE結果相比較，探討其對VP的分型能力，為VP的快速分型和溯源提供技術基礎。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗菌株

食品中分離的VP 21株，為本實驗室和中國檢驗檢疫科學研究院食品所保存菌株，均用API 20E和VITEK2確認為VP，菌株信息見表1。PFGE分子量標準沙門氏菌H9812為本實驗室保存菌株。

2.1.2 主要儀器和試劑

DVL系統(tǒng)、REP－PCR試劑盒及微流體芯片：法國梅里埃公司;

PTC－200型PCR儀、CHEF MAPPER脈沖場電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)：美國Biorad公司;

一次性血瓊脂平板：廣州環(huán)凱公司。

2.2 方法

2.2.1 DNA 提取

用接種環(huán)刮取血平板上分離純化的VP菌落，使用REP－PCR配套核酸提取試劑盒，按照廠家說明書推薦步驟提取 DNA，DNA濃度控制在25－50ng/uL。

2.2.2 REP －PCR 分型

以提取的VP DNA為模版，使用DVL配套的REP－PCR試劑盒進行PCR擴增，PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃ 2min，94℃30s，50℃30s，70℃90s，35 個循環(huán)，70℃ 3min，反應體積為25uL。PCR擴增產(chǎn)物注入微流體芯片放入DVL系統(tǒng)進行電泳。DVL系統(tǒng)自動生成分析報告，包括聚類分析樹狀圖、凝膠圖像虛擬圖、矩陣圖。

2.2.3 PFGE 分型

21株VP中選擇 VP1、VP3、VP5、VP8、VP9、VP10、VP16，共7株進行 PFGE分型，方法按照文獻報道［3］進行，限制性內(nèi)切酶用NotⅠ。電泳條件為起始轉換時間為10.0s，最終轉換時間為 32.5s，電泳時間18h。分子量標準沙門氏菌H9812的PFGE分型按照文獻報道［4］進行。

3 結果

3.1 REP－PCR分型結果

DVL系統(tǒng)將21株VP分為16個群，菌株之間的相似度在64.5% －99.1%，VP21、VP10分布在1群，VP1、VP7分布在 2群，VP2、VP4在 3群，VP3、VP22在 11群，VP6、VP12在 15群，VP23、VP5、VP15、VP18、VP16、VP14、VP8、VP13、VP14、VP9、VP11分別分布在4群、5群、6群、7群、8群、9群、10群、12群、13群、14群、16群，詳見圖1。圖1顯示，分離自相同地區(qū)、相同食品中的VP分在同一個群。如VP1、VP7分離自廣東無頭凍蝦，2株菌分在2群;VP2、VP4分離自廣東出口凍蝦仁，2株菌分在3群;VP6、VP12分離自廣東地區(qū)凍蝦仁，2株菌株分在15群。但也有發(fā)現(xiàn)分離自不同地區(qū)、不同食品中的VP分在同一個群中。如VP21分離自孟加拉凍墨魚，VP10分離自廣東蝦，2株菌株分在1群;VP3、VP22分別分離自廣東熟鳳尾蝦和生蠔，2株菌株分在11群。

3.2 REP－PCR與PFGE分型結果比較

7株VP用NotⅠ酶切PFGE電泳后，共有7個不同的PFGE型別，菌株之間相似度27.07% －84.37%，見圖2。按照PFGE結果判斷標準，7株VP是相互不相關的菌株;而 VP1、VP3、VP5、VP8、VP9、VP10、VP16在REP－PCR樹狀圖上分別分布在2、11、5、10、14、1、8 不同的 7 個群中。

4 討論

REP－PCR是以細菌DNA中串聯(lián)重復序列為引物，對細菌基因組DNA進行擴增，得到指紋圖譜并進行分析。WONG等研究評價了REP－PCR對副溶血性弧菌的分型方法，其分型能力與PAGE相當，優(yōu)于核糖體分型方法，但其簡捷性和實用性是PAGE 方法所無可比擬的［5，6］。DVL 是自動化的REP－PCR分型系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用一個標準化算法，可以在4h內(nèi)自動化分析13個樣品，包括獲得聚類分析樹狀圖、凝膠圖像虛擬圖、矩陣圖等報告，克服了手動REP－PCR實驗室間重復性差，周轉時間長，并且需要瓊脂糖凝膠電泳進行DNA分離和檢測的缺點，加快了細菌分子流行病學研究［7］。

圖1 21株VP REP－PCR分型樹狀圖和矩陣圖

圖2 7株VP PFGE分型聚類分析樹狀圖

本研究用DVL系統(tǒng)對食品中分離的21株VP進行REP－PCR分型，結果21株VP分成16個群，REP－PCR型別分散，表現(xiàn)出較大的遺傳多樣性。這可能與樣品來自不同地區(qū)和不同廠家，而且分離菌株的年份相隔較遠有關。同時也發(fā)現(xiàn)，分別從相同食品中分離的VP1和 VP7、VP2和VP4、VP6和VP12，在聚類圖上分別分在2、3、15群，而且菌株之間有不可分辨的REP－PCR型。這一結果提示，來自相同食品中的VP是否均有不可分辨的REPPCR型，DVL系統(tǒng)能否應用于食品中VP污染源的追蹤、溯源，這有待于今后的進一步研究。

DVL系統(tǒng)對于REP－PCR分型結果的解釋，廠家建議的判斷標準是：相似性大于97%，沒有條帶的差異，判斷為不可辨別的菌株;相似性大于95%，有1－2條不同的條帶，判斷為相似菌株;相似性小于95%，有多條不同的條帶，則判斷為不同菌株。但研究發(fā)現(xiàn)，在實際工作中對菌株進行分群時，要根據(jù)產(chǎn)生的電泳條帶比較，在97%的水平上適當上調(diào)或下調(diào)相似性百分數(shù)，本研究是按上述原則，在菌株之間相似性為96.6%水平上對VP進行了分群。

雖然上述DVL系統(tǒng)的判斷標準不夠明確，但卻具有簡便、快速的特點，可廣泛應用于分支桿菌、腦膜炎奈瑟菌、鮑曼不動桿菌的分子分型，為臨床實驗室提供了一個可靠的 REP－PCR 分型系統(tǒng)［8，9］。B.healy等(阪崎腸桿菌的新分類名)用DVL系統(tǒng)和PFGE對 Cronocacter菌屬進行分型比較中發(fā)現(xiàn)，DVL系統(tǒng)把 C.malonatius和 C.dublinensis分在不同的群中進行REP－PCR聚類分析，比PFGE更能分辨一些分類群中菌株的關系，其種群分類能力比PFGE優(yōu)勝［10］。本研究7株VP的 PFGE分型結果分析發(fā)現(xiàn)，7株PFGE型別不同、按PFGE判斷標準彼此不相關的VP，在REP－PCR樹狀圖上分別分布在7個不同的群中，而且7株VP按照DVL系統(tǒng)的判斷標準也是不同的菌株，表明DVL系統(tǒng)在VP的分群能力和分辨率上與PFGE分型結果相似。

總之，在VP的分型方法中，DVL系統(tǒng)是一種快速、簡便的分型方法，其種群分類能力和分辨率也比較高，可應用于VP的快速分型和溯源。

［1］董雪，王秋雨，金莉莉.副溶血性弧菌分子分型和檢測研究進展［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18(2)：379 －381.

［2］T L Ross，W G Merz，M Farkosh.Comparison of an automated repetitive sequence－based PCR microbial typing system to pulsed－field gel electrophoresis for analysis of outbreaks of methicillinresistant staphylococcus aureus［J］.Journal of clinical microbiology，2005，43(11)：5642 －5647.

［3］Cooper K L，Luey C K，Bird M，et al.Development and validation of a pulse net standardized pulsed2field gel electrohoresis protocol for subtyping of vibrio cholerae［J］.Foodborne Patbog Dis，2006，3(1)：51 －58.

［4］許龍巖，袁幕云，劉靜宇，等.進出口食品中沙門氏菌PFGE分型及耐藥研究［J］.檢驗檢疫科學，2010，20(2)：14 －17.

［5］WONG H C，LIN C H.Evaluation of Typing of Vibrio parahaemolyticus by Three PCR Methods Using Specific Primers［J］.J Clin Microbiol，2001，39(12)：4233－4240.

［6］金莉莉，董雪，王秋雨.副溶血性弧菌重復序列－PCR分型研究［J］.微生物學通報，2008，35(3)：389－394.

［7］Healy M，J Huong，T Bittner，et al.Microbial DNA typing by au-tomated repetitive－sequence－based PCR［J］.J Clin Microbiol，2005，43：199 －207.

［8］Cangelosi G A，R J Freeman，K N Lewis，et al.Evaluation of a high－throughput repetitive－sequence－based PCR system for DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium complex strains［J］.J Clin Microbiol，2004，42：2685－2693.

［9］曲燕燕，王文飛，周華，等.DiversiLab系統(tǒng)鮑曼不動桿菌基因分型可行性研究［J］.中華檢醫(yī)學雜志，2010，33(5)：425－429.

［10］B Healy，N Mullane，V Collin，et al.Evaluation of an automated repetitive sequence-based PCR system for subtyping Enterobacter sakazakii［J］.Journal of Food Protection，2008，71(7)：1372－1378.