王青，鄭永平

1.香港理工大學 醫(yī)療科技及資訊學系，香港；2. 南方醫(yī)科大學 生物醫(yī)學工程學院，廣東 廣州 510515

運用滲透性膨脹和超聲顯微成像彈性技術(shù)研究關(guān)節(jié)軟骨的力學特性

王青1，2，鄭永平1

1.香港理工大學 醫(yī)療科技及資訊學系，香港；2. 南方醫(yī)科大學 生物醫(yī)學工程學院，廣東 廣州 510515

關(guān)節(jié)軟骨是覆蓋在關(guān)節(jié)骨表面的重要承重組織，其結(jié)構(gòu)與成分的變化均會造成軟骨的退化，從而最終導致骨關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生，因此研究關(guān)節(jié)軟骨的力學性質(zhì)具有重要意義。該研究通過改變關(guān)節(jié)軟骨外溶液的離子濃度引起軟骨的滲透性膨脹行為，結(jié)合超聲顯微彈性成像技術(shù)，依據(jù)超聲回波計算得到軟骨不同深度的位移變化量，繪制軟骨內(nèi)部組織彈性成像并預測了隨深度變化的軟骨軸向模量。該研究表明利用超聲顯微彈性成像技術(shù)可以有效觀測軟骨內(nèi)部由滲透壓力引起的膨脹行為, 并可以描述關(guān)節(jié)軟骨的力學性質(zhì)，為研究關(guān)節(jié)軟骨早期病變提供一個有效可行的方法。

關(guān)節(jié)軟骨；滲透性膨脹；彈性成像；超聲顯微彈性成像

1 概論

關(guān)節(jié)軟骨是一種十分特殊的結(jié)締組織，覆蓋在活動關(guān)節(jié)骨組織上，其表面光滑，可減小關(guān)節(jié)運動時的摩擦力，分散壓力負荷。關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)主要由水、膠原與蛋白多糖組成[1-3]。膠原呈網(wǎng)架排列，決定軟骨的形狀和張力剪力特性；蛋白多糖多呈大分子聚合體狀態(tài)；蛋白多糖和水使得軟骨富有彈性。研究發(fā)現(xiàn)蛋白多糖攜帶負電荷，吸引陽性離子來保持其電中性[1-3]。因此，組織間隙內(nèi)產(chǎn)生膨脹壓力，膨脹壓力的大小主要由 Donnan 滲透壓決定，還受負電荷之間的靜電排斥力的影響[1-3]。同時膨脹壓力受到膠原纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的限制，蛋白多糖的彈性和膠原纖維的張力之間保持著平衡，這個平衡在維持關(guān)節(jié)軟骨的正常生物力學特性方面起到重要作用[3]。在骨關(guān)節(jié)炎等病變條件下，軟骨的結(jié)構(gòu)與組成發(fā)生改變，如水分的增加，蛋白多糖的解體，膠原網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的破壞等，上述力平衡被打破 , 軟骨的生物力學特性亦隨之變化。過去的研究顯示，對關(guān)節(jié)軟骨膨脹效果的觀察與測量可以預測關(guān)節(jié)軟骨退化疾病[4-5]。

引起關(guān)節(jié)軟骨膨脹的常用方法是通過改變軟骨外溶液的離子濃度，產(chǎn)生滲透壓，從而破壞膨脹壓力與膠原纖維張力之間的力平衡。近來有研究者用光學方法描述關(guān)節(jié)軟骨的膨脹行為[5-8]，雖取得較好結(jié)果，但光學方法只能觀察軟骨樣品的外橫截面變化，卻無法觀察內(nèi)部變化。鄭永平等人研發(fā)的超聲顯微成像系統(tǒng)可實時觀測樣本內(nèi)部變化[9-10]，不僅可以探測軟骨蛋白多糖與胰蛋白酶之間的相互作用[11-12]，而且在研究軟骨隨深度變化的膨脹行為方面，取得了良好進展[13-14]。

目前，超聲彈性成像成為臨床研究的熱點。超聲彈性成像的基本原理是對組織施加一個內(nèi)部（包括自身的）或外部的激勵，組織內(nèi)部將產(chǎn)生位移或應(yīng)變分布方面的變化，利用超聲成像方法，結(jié)合數(shù)字信號/圖像處理技術(shù)，估計出組織內(nèi)部的相應(yīng)情況，從而間接或直接反映組織內(nèi)部的彈性模量等力學屬性的差異。由于腫塊組織與正常軟組織有明顯的彈性系數(shù)（應(yīng)力/應(yīng)變）差異，它們對激勵產(chǎn)生不同響應(yīng)，產(chǎn)生不同的位移和形變，因而超聲彈性成像技術(shù)在探測病變軟組織，如肝臟、前列腺、乳房等，取得了良好的效果[15-17]。結(jié)合軸向壓力與超聲顯微成像，鄭永平等人發(fā)展了二維高頻超聲顯微彈性成像系統(tǒng)，成功獲得了關(guān)節(jié)軟骨的彈性圖像[18]。

本文通過調(diào)控軟骨外溶液離子濃度，引入滲透壓力，刺激軟骨發(fā)生膨脹，利用高頻超聲顯微彈性成像系統(tǒng)，實時觀測軟骨內(nèi)部組織的變化，繪制彈性圖像，建立四參數(shù)三相模型估計軟骨不同深度的軸向模量。

2 方法

2.1 軟骨滲透性膨脹實驗

關(guān)節(jié)軟骨樣品取自新鮮成年牛的膝蓋骨，放入 -20℃冰箱待用。實驗開始前，取出軟骨樣品，放在生理鹽水（0.15 mol/L 的氯化鈉溶液）中解凍 3 h。

圖1 滲透壓引起的軟骨膨脹行為的M模式超聲圖像

實驗時，圓柱形樣品的軟骨表面向上，軟骨下連接的骨組織向下，固定于容器底部的凹槽內(nèi)。容器中注入2mol/L 的氯化鈉溶液（高滲鹽水），液面漫過超聲換能器。軟骨表面與溶液接觸，周圍用橡皮泥膠黏住以防止溶液從側(cè)面滲入，目的在于模擬軟骨在體內(nèi)的狀態(tài)，同時認為軟骨只在一個方向（軸向）上膨脹，以便計算其單軸軸向彈性模量。觀測1h后，達平衡狀態(tài)。本實驗選擇該狀態(tài)（軟骨外溶液為 2 mol/L 氯化鈉）為參考狀態(tài)，在參考狀態(tài)下離子被有效屏蔽，膨脹效果可忽略不計[8,19]。平衡后，30 s 之內(nèi)迅速用 0.15 mol/L 氯化鈉溶液代替 2 mol/L 氯化鈉溶液。換液后，外溶液的離子濃度低于軟骨內(nèi)部的離子濃度，這種不平衡產(chǎn)生 Donnan 滲透壓[1]，在滲透壓力的作用下，軟骨內(nèi)外離子流動，使得軟骨膨脹，1h之后軟骨接近一個新平衡狀態(tài)。圖1為軟骨膨脹的M模式超聲圖像。

2.2 超聲顯微彈性成像系統(tǒng)

超聲顯微彈性成像系統(tǒng)如圖2所示，包括、一個50MHz聚焦超聲換能器（Panametrics, Waltham, MA, USA，聚焦長度 12.7 mm，超聲波束直徑為 0.1 mm）、一臺寬帶超聲脈沖發(fā) 射 接 收 器（5601A 型 , Panametrics, Waltham, MA, USA）、一塊由超聲脈沖發(fā)射接受器觸發(fā)的 500 MHz 八位數(shù)據(jù)采集卡（CompuScope 8500PCI 型 , Gage, Canada）、 一 套 電 機 驅(qū)動 的 三 維 支 架 系 統(tǒng) (Parker Hannifin Corporation, Irvine, CA, USA)、一個實驗平臺、一臺計算機和自行開發(fā)的信號采集與處理軟件。盛放樣品的容器固定在實驗平臺上，超聲換能器固定于三維支架系統(tǒng)的機械臂上。計算機控制機械臂三維運動，可將換能器調(diào)置到軟骨樣品上方合適的位置，在膨脹實驗中驅(qū)動機械臂完成對樣品的掃描。

圖2 超聲顯微彈性成像系統(tǒng)組成框圖

圖3 超聲顯微彈性成像系統(tǒng)的信號采集與處理軟件界面二維B超圖像中的虛線框為感興趣區(qū)域。

軟骨表面、組織內(nèi)部、及軟骨與骨的界面產(chǎn)生的超聲回波由超聲脈沖發(fā)射接收器接收放大后，經(jīng)數(shù)據(jù)采集板采集再存入計算機。通過信號采集與處理軟件，以一維超聲信號和二維超聲圖像實時觀測滲透壓引起的軟骨膨脹行為。計算軟骨內(nèi)部位移分布時，在超聲圖像內(nèi)選擇感興趣區(qū)域，該區(qū)域又被劃分為 40×15 個子區(qū)域，兩幀圖像的時間間隔Δt 為 1.6 min，由信號采集與處理軟件自動計算每塊子區(qū)域的位移值并繪制膨脹過程中軟骨內(nèi)部組織位移變化的分布圖。信號采集與處理軟件界面如圖3所示。

2.3 軟骨三相模型

1991 年 Lai WM 等人提出軟骨三相理論[20]，三相理論認為關(guān)節(jié)軟骨由膠原-蛋白多糖構(gòu)成的基質(zhì)固相、組織間液的液相、以及 Na+和 Ca2+等離子作為第三相組成。比較兩相理論（軟骨僅由固相和液相組成）[21]，三相理論更全面地描述了軟骨的力學特性[19-20]。膨脹過程，滲透性負載與力學負載類似 , 可導致軟骨組織形變?；谌嗬碚?，三相模型可以描述關(guān)節(jié)軟骨的材料屬性，提取軟骨的彈性模量[19,22]。

膨脹壓是關(guān)節(jié)軟骨總應(yīng)力的主要部分，與軟骨的成分、電荷及水的分布相關(guān)。研究顯示，蛋白多糖、膠原纖維、電荷密度和水分隨軟骨深度不均勻地分布[23]。因而，膨脹引起的應(yīng)變亦隨軟骨深度的變化而變化，建立軟骨三相模型時必須考慮這個不均勻性，才能準確描述膨脹引起的應(yīng)變。我們建立了四參數(shù)三相模型[22]，如圖4 所示。

圖4 軟骨四參數(shù)三相模型

在模型中，軟骨分為兩層 : 第一層為軟骨深層，厚度（即分層位置）為h1，底部與骨組織相連，材料屬性主要由軸向模量Ha1，Ha2和泊松比νs三個參數(shù)確定，并假設(shè)從軟骨 -骨界面開始到第一層和第二層的分界面之間，軸向模量從Ha1到Ha2線性變化 ; 第二層為軟骨淺層， 材料屬性由軸向模量Ha2，Ha3和泊松比νs 三個參數(shù)確定，同樣假設(shè)從第一層和第二層的分界面開始到軟骨表面之間，軸向模量也是線性變化。由于考慮了中間分界面的軸向模量，從理論上說該模型比單層模型更準確描述軟骨。四個參數(shù)Ha1，Ha2，Ha3和h1結(jié)合軟骨的生化參數(shù)（固定電荷密度 C0F和水體積分數(shù) φ0W），根據(jù)因離子濃度變化而引起的軟骨膨脹狀況，就可以描述軟骨的生物力學特性。

軟骨組織不同深度的膨脹位移量根據(jù)實時超聲回波信號運用互相關(guān)跟蹤算法計算[13,22]，得到應(yīng)變場。由于軟骨組織成分分布的不均勻性和軟骨的膨脹，超聲在關(guān)節(jié)軟骨中傳播速度的變化必須考慮。我們測定了始末時刻超聲在軟骨組織中的傳播速度，實驗測量數(shù)據(jù)按照始末時刻差值的深度比例進行了線性補償[22]。把實驗計算的應(yīng)變數(shù)據(jù)作為模型的輸入數(shù)據(jù)，預測得到關(guān)節(jié)軟骨樣品的軸向模量。

3 結(jié)果

根據(jù)超聲回波信號，利用二維互相關(guān)跟蹤算法[18]，計算出不同時刻的組織內(nèi)部因膨脹而引起的位移分布圖像，如圖5 所示。當氯化鈉溶液的離子濃度從 2 mol/L 突然減少到 0.15 mol/L 時，滲透壓使得組織產(chǎn)生較大變形，但隨著時間的延長至約 10 min，可以看到內(nèi)部的形變減小，趨于平衡。

根據(jù)膨脹引起的位移分布，計算得到的軟骨樣品在不同深度的應(yīng)變量。根據(jù)四參數(shù)三相模型，預算得到由深到淺的三個軸向彈性模量參數(shù)Ha1，Ha2和Ha3，軟骨樣品的分層位置h1=0.7±0.2（軟骨厚度歸一化后的位置）。表1列出軟骨樣品在不同深度的力學屬性參數(shù)。

圖5 軟骨樣品的外溶液濃度從2 mol/L 減少到0．15 mol/L后，不同時刻的組織內(nèi)部因膨脹而引起的位移分布圖像

表1 四參數(shù)三相模型的預測結(jié)果 ：軟骨組織不同深度的應(yīng)變量ε與軸向模量Ha

4 討論

關(guān)節(jié)軟骨的膨脹行為及力學特性的改變是關(guān)節(jié)炎初期的重要指征[2,5,24]。本研究通過滲透壓力引入軟骨的膨脹行為，運用超聲顯微成像技術(shù)，繪制出軟骨膨脹時內(nèi)部組織的動態(tài)變化，建立四參數(shù)三相模型，研究關(guān)節(jié)軟骨的隨深度變化的彈性模量，更準確地描述軟骨的力學特征。

與光學等其他方法[4-8]相比，超聲技術(shù)可以對組織內(nèi)部的變化進行無損觀測，使用實時二維超聲彈性成像技術(shù)成功地繪制出軟骨組織內(nèi)部變化情況[18]。而利用軟骨外溶液的離子濃度的變化引起滲透壓力，無需在樣品上施加額外壓力，因此該方法很適合小樣品的檢測，而且將小型超聲轉(zhuǎn)換器裝在內(nèi)窺鏡上，則更有希望成為臨床軟骨病變檢測技術(shù)[13,25-26]。

Narmoneva 等人[5,6,8]認為軟骨組織的材料屬性是隨深度變化而變化的 , 建立了三個參數(shù)的模型，雖然把淺層軟骨組織的軸向模量看作是線性變化的 , 但是卻把深層軟骨組織的模量看作是不變的。而過去的研究表明，軟骨的組織成分包括蛋白多糖、膠原纖維、電荷密度和水分均隨深度不均勻地分布[23]。本研究建立了四參數(shù)三相模型，假設(shè)深層軟骨組織的軸向模量亦為線性變化，由于增加了對中間分界面的軸向模量的估計，因而從理論上講，與單相模型和三參數(shù)三相模型相比，該模型能更準確地描述隨深度變化的軟骨組織的力學特征。這也說明 , 運用超聲顯微彈性成像技術(shù)，基于滲透性膨脹建立關(guān)節(jié)軟骨的四參數(shù)三相模型，可以有效地以無損方式測量關(guān)節(jié)軟骨的材料屬性。

總之 , 超聲顯微彈性成像技術(shù)對關(guān)節(jié)軟骨膨脹行為、力學特征和材料屬性的估計，對軟骨組織進行性病變的研究，以及人工關(guān)節(jié)軟骨材料的研制都有重要意義。除此之外 ,該研究對于臨床骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷具有潛在的應(yīng)用價值,對材料的多孔介質(zhì)力學研究以及其他相關(guān)領(lǐng)域的研究也具有借鑒意義。

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Study on Elasticity of Articular Cartilage using Osmosis-Induced Swelling and Ultrasound Elastomicroscopy

WANG Qing1,2, ZHENG Yong-ping11.Department of Health Technology and Informatics，The Hong Kong Polytechnic University，Hong Kong, China; 2. School of Biomedical Engineering, Southern Medical University, Guanzhou Guangdong 510515, China

Articular cartilage is important weight-bearing connective tissue covering the articulating bony ends in diarthrodial joints. The structural or component changes of articular cartilage induce degenerations of the tissue and consequently cause osteoarthritis (OA). In this study, we used osmosis loading to induce swelling behavior of articular cartilage and apply ultrasound elastomicroscropy to map the depth-dependent deformations in the tissue. The intrinsic layered material parameters of the articular cartilage were extracted using a triphasic model. Results showed that the ultrasound elastomicroscropy system could investigate the mechanical properties of articular cartilage associated with osmosis-induced swelling behavior of articular cartilage in a non-contact way. This method could be potential to assess the progressive degeneration of cartilage for the early diagnosis of OA.

articular cartilage; osmosis-induced swelling; elastography; ultrasound elastomicroscopy

R445.1

B

10.3969/j.issn.1674-1633.2011.01.004

1674-1633(2011)01-0013-04

2010-11-01

香港研究資助局和香港理工大學(PolyU5199/02E, PolyU 5245/03E, J-BB69)基金項目支持。

鄭永平，教授。

通訊作者郵箱：ypzheng@ieee．org