史樹德，魏 磊，張子義，邵金旺，田自華

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)甜菜生理研究所，呼和浩特 010018）

甜菜是我國主要經(jīng)濟(jì)作物之一，其不僅是主要的制糖工業(yè)原料，也是發(fā)展畜牧業(yè)的優(yōu)良飼料，更是新興的能源作物，在農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和發(fā)展地方經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。但由于中國不是甜菜起源國，缺少種質(zhì)資源，再加之相關(guān)研究積淀較薄，使我國的甜菜研究水平整體落后，甜菜育種水平落后于發(fā)達(dá)國家。而隨著基因組學(xué)研究的飛速發(fā)展，分子設(shè)計(jì)育種成為作物遺傳改良的重要途徑之一，新的分子標(biāo)記不斷被開發(fā)和廣泛應(yīng)用，從而加速了作物基因組輔助育種和設(shè)計(jì)育種的進(jìn)程[1]。近幾年，國內(nèi)外在甜菜分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究正在興起，但可利用分子標(biāo)記的匱乏嚴(yán)重制約其發(fā)展。目前，在甜菜基因組輔助育種研究中應(yīng)用到的分子標(biāo)記十分有限，僅有關(guān)于 RAPD[2－6]、AFLP 和 SNP[7]以及少數(shù) SSR[8－11]、ISSR[12]標(biāo)記的初步報(bào)道，其中可利用的甜菜SSR標(biāo)記很少。

簡單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSRs）或微衛(wèi)星（microsatellites）是以 1～6個(gè)堿基為基元的串聯(lián)重復(fù)序列，它們普遍存在和均勻分布于大多數(shù)真核生物的基因組中，重復(fù)數(shù)高度變異[13－15]。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、容易用PCR檢測、重復(fù)性高等特點(diǎn)，作為理想的分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用到許多植物的遺傳學(xué)研究中[16－18]。SSR標(biāo)記的開發(fā)有幾種[19-22]。EST-SSR是近年發(fā)展起來的新型分子標(biāo)記，作為表達(dá)基因部分序列的EST和cDNA數(shù)據(jù)近年來高速增加。截至2011年3月1日，GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST）中的甜菜EST數(shù)據(jù)已有29830條。EST-SSR反映了基因的編碼部分，可以直接獲得基因表達(dá)的信息，為功能基因提供“絕對(duì)”的標(biāo)記，使得有可能對(duì)決定重要表型或農(nóng)藝性狀的等位基因進(jìn)行直接鑒定，省去了SSR引物開發(fā)過程中的克隆和測序步驟，充分利用了現(xiàn)有測序數(shù)據(jù)，降低了開發(fā)成本，EST-SSR的開發(fā)在多種作物中已有報(bào)道[23-27]。

為此，本研究目的是利用GenBank中已有的EST序列，開發(fā)基于EST序列的SSR標(biāo)記，并用其進(jìn)行甜菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性驗(yàn)證，以篩選多態(tài)性高、重復(fù)性好的EST-SSR標(biāo)記；評(píng)價(jià)收集的甜菜種質(zhì)資源遺傳多樣性，為建立甜菜高密度遺傳圖譜、功能性分子標(biāo)記發(fā)掘、重要農(nóng)藝性狀QTLs克隆等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)所用甜菜品種為甜研309和KWS9412，KWS9419，KWS5416，農(nóng)大甜研4號(hào)和包育302，種植于溫室，采用CTAB法[28]提取甜菜苗期新鮮葉片基因組DNA。

1.2 EST-SSR的引物開發(fā)

首先計(jì)算機(jī)安裝PC版perl程序，然后從GenBank/dbEST（http：//www.ncbi.nlm.nih/entrez）中以FASTA格式下載sugar beet和Beta vulgaris L.中所有的EST序列，共29830條。 利用Blastclust（v.2.2.10；http：//www.ncbi.nih.gov/web/newsltr/spring04/blastlab.htm）軟件，對(duì)這些EST序列進(jìn)行冗余性查找，利用CD_HIT（http：//www.bioinformatics.org/cd-hit/）快速批量去冗余序列；利用 est_timmer（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）去除EST 序列中過短的序列（＜100bp）和過長的序列（＞700bp）以及 mRNA 的“帽子”和“尾巴”，利用 misa.pl（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）識(shí)別和定位SSR，其中配置文件misa.ini用來設(shè)置識(shí)別SSR標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)；利用primer3模塊批量設(shè)計(jì)SSR引物，引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)是，引物長度20～26bp；退火溫度Tm值48℃～65℃；（G＋C）含量30%～70%；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度大于150bp；利用MacVector7.0軟件對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行驗(yàn)證，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 EST-SSR的擴(kuò)增與檢測

PCR反應(yīng)在25μL的體積中進(jìn)行，含PCR緩沖液、50～80 ng的模板DNA、1.5 U Taq聚合酶，上、下游引物各0.5μmol/L、200μmol/L dNTP和2.0 mmol/L MgCl2。整個(gè)反應(yīng)過程在PE 9700上進(jìn)行，循環(huán)條件是：94℃預(yù)變性3min；然后35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45s，復(fù)性的合適溫度通過溫度梯度實(shí)驗(yàn)確定，并盡可能提高復(fù)性溫度以增加特異性，復(fù)性時(shí)間60s，72℃延伸1min 20s；最后于72℃延伸8min。復(fù)性溫度低于50℃仍無產(chǎn)物出現(xiàn)，則認(rèn)為該引物不能擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 多態(tài)信息含量和遺傳相似系數(shù)分析

多態(tài)信息含量常被用來評(píng)估所設(shè)計(jì)引物的潛在利用率。本實(shí)驗(yàn)的每個(gè)EST-SSR引物的多態(tài)信息含量按Park等[29]提供的公式計(jì)算，即其中Pi為i位點(diǎn)的基因頻率，n為等位基因數(shù)。遺傳相似系數(shù)分析利用NTSYS-pc軟件[30]的SIMQUAL模塊計(jì)算6個(gè)甜菜品種間的遺傳相似系數(shù)。然后基于遺傳相似系數(shù)矩陣，依據(jù)UPGMA算法并利用NTSYS-pc軟件的SHAN聚類程序?qū)?個(gè)材料進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 甜菜EST-SSR的特征

從NCBI網(wǎng)站下載的29830條主要來源于sugar beet和Beta vulgaris L.的EST序列（截止2011年3月1日）。經(jīng)過除去ploy A或T“尾巴”和載體等序列后共獲得20109條無冗余EST序列，序列總長度為11287687bp。按照上述查找標(biāo)準(zhǔn)，共發(fā)現(xiàn)6951條至少含有1個(gè)SSR的EST序列，占無冗余EST總數(shù)的34.6%，表明甜菜EST-SSR含量比較豐富。按照SSR具體實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)要求，從4338個(gè)SSR重復(fù)中設(shè)計(jì)得到2845對(duì)EST-SSR引物。這些引物對(duì)中有1052個(gè)含有1個(gè)SSR重復(fù)，其余1793對(duì)含有2個(gè)或2個(gè)以上的SSR重復(fù)。在鑒定的SSR中A/T單堿基重復(fù)最多，其最少重復(fù)9次，最大重復(fù)28次；AAG/CTT三核苷酸重復(fù)次之，最少重復(fù)5次；AG/CT二核苷酸重復(fù)居第三，最少重復(fù)6次；四、五和六核苷酸重復(fù)數(shù)量最少，其最少重復(fù)5次（見表1）；在同一條EST序列中所含2個(gè)SSR位點(diǎn)之間最小相距2個(gè)核苷酸，最大相距100個(gè)核苷酸。其中除單核苷酸重復(fù)外，AAG/CTT三核苷酸重復(fù)基元是出現(xiàn)頻率最高的EST-SSR類型，占總SSR的12.7%，AG/CT次之，占10.4%，ACCTCC/AGGTGG等六核苷酸重復(fù)最少，約占1%。

表1 在20109條甜菜EST序列中發(fā)掘的不同基元的SSR數(shù)量及百分率統(tǒng)計(jì)

2.2 EST-SSR引物的擴(kuò)增效率

在所得的2845對(duì)SSR引物中隨機(jī)挑選并合成了100個(gè)SSR引物對(duì)，在前述給定的條件下對(duì)6個(gè)品種甜菜基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有47對(duì)（47%）引物擴(kuò)增出了SSR特征條帶，共產(chǎn)生621個(gè)位點(diǎn)，平均每對(duì)引物產(chǎn)生13.2個(gè)位點(diǎn)。表2為47個(gè)具有功能性引物對(duì)的相關(guān)信息。在47個(gè)功能性引物對(duì)中，有14個(gè)引物對(duì)（29.7%）擴(kuò)增出1條產(chǎn)物帶，有25個(gè)引物對(duì)（31.9%）擴(kuò)增出2條條帶，8個(gè)引物對(duì)（17.2%）擴(kuò)增出2條以上條帶；有38個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物在預(yù)期片段大小范圍之內(nèi)，占功能性引物對(duì)的80.8%，9個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物小于預(yù)期片段大小；此外，在33個(gè)擴(kuò)增出2條或2條以上條帶的引物對(duì)中，有9個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增出比預(yù)期片段大的條帶，在47個(gè)功能性引物對(duì)中，有25個(gè)引物對(duì)在6個(gè)甜菜品種間擴(kuò)增出多態(tài)性，多態(tài)性引物對(duì)占53.2%。25個(gè)引物對(duì)在6個(gè)品種中共擴(kuò)增出138個(gè)多態(tài)性標(biāo)記。

2.3 EST-SSR引物的多態(tài)性分析

每對(duì)引物的多態(tài)性信息含量用PIC值表示，并用量估計(jì)等位基因的變異情況。依據(jù)47對(duì)引物在6個(gè)甜菜品種中擴(kuò)增得到的等位基因的變異信息來計(jì)算各引物的PIC值。它們的PIC值變化在0.13～0.71之間，平均為0.47，引物S9的PIC值最大，達(dá)0.71；而引物S10的最小，只有0.13。

2.4 遺傳相似系數(shù)分析

基于這 25個(gè)多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記，依據(jù)UPGMA算法利用NTSYS-pc2.1軟件將本研究所用6個(gè)甜菜品種進(jìn)行聚類分析，可將6個(gè)品種劃分為不同的兩組（圖1）：第一組為國內(nèi)品種，其中甜研309與農(nóng)大甜研4號(hào)和包育302親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，第二組為親緣關(guān)系較近的德國KWS系列3個(gè)品種，系統(tǒng)發(fā)育分析表明國內(nèi)外兩組材料親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似度較低，相似系數(shù)為0.31。

表2 甜菜ESTs中分離到的部分微衛(wèi)星引物

3 討論

與其他分子標(biāo)記相比，EST-SSR標(biāo)記來自表達(dá)基因的全部或部分序列，其多態(tài)性可能直接與該基因功能相聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，水稻的蠟質(zhì)基因5'端非編碼區(qū)中的SSR序列（CT）n長度變化不僅與直鏈淀粉的含量有關(guān)[31]，而且還決定了糯稻淀粉的理化特性[32]。因此根據(jù)EST包含的SSR位點(diǎn)開發(fā)的分子標(biāo)記，是直接與功能相關(guān)的功能標(biāo)記[33]，EST-SSR標(biāo)記的這一特點(diǎn)決定了其在功能基因標(biāo)記方面應(yīng)用前景廣闊。

本研究中，多態(tài)信息位點(diǎn)PIC值變化在0.13～0.71之間，較已知甜菜SSR標(biāo)記PIC值低[34]，可能是由于EST標(biāo)記來源于基因編碼區(qū)，具有很高的保守性，因此它們在品種之間的多態(tài)性要低于來源其它基因組區(qū)域分子標(biāo)記[35]，但是通過根據(jù)EST 5'端或3'端的UTR區(qū)開發(fā)的SSR標(biāo)記多態(tài)性要稍好些[33]。因此，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，可設(shè)定軟件條件，應(yīng)盡量使引物靠近3'或5'端非編翻譯區(qū)。本研究中較低的PIC值與張艷欣和Taliercio等人的研究結(jié)果一致[36，18]，表明基于表達(dá)基因的EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性確實(shí)低于基因組SSR[37]。在100對(duì)引物中有47對(duì)成功擴(kuò)增出了SSR特征條帶，其它未獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的引物可能的原因是正向引物或反向引物或二者都恰好跨過了mRNA的剪切位點(diǎn)，也可能是由于在相應(yīng)的基因組DNA中存在較大的內(nèi)含子，這兩個(gè)原因都會(huì)導(dǎo)致引物無法與模板DNA結(jié)合而不能擴(kuò)增，從而導(dǎo)致擴(kuò)增效率較低?；谶z傳相似系數(shù)的聚類分析表明，國內(nèi)和國外品種間遺傳差異度較大，可能是其親本來源不同所致。本研究中，三核苷酸重復(fù)數(shù)量高于二核苷酸重復(fù)，此結(jié)果與EST中三核苷酸比二核苷酸更為豐富的結(jié)論相符[32]。

綜上，EST-SSR標(biāo)記易于開發(fā)、成本較低，其功能可以通過序列同源性比對(duì)獲得。而且由于來自于轉(zhuǎn)錄譜，能夠反映出轉(zhuǎn)錄區(qū)的差異，使得EST-SSR標(biāo)記在遺傳多樣性分析、比較作圖和分子標(biāo)記輔助選擇育種的研究中具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

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