高文偉 ，馬 林，沙 紅，曲延英，于月華，劉 珊 ，李玉嬌，王燕飛

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所，烏魯木齊 830091）

分子標(biāo)記輔助育種是利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA來對目標(biāo)性狀進行間接性選擇，早代就能夠?qū)δ繕?biāo)基因的轉(zhuǎn)移進行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且克服隱性基因再度利用識別的困難，從而加速育種進程，提高育種效率，選育抗病、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的品種[1-13]。我國的農(nóng)作物分子標(biāo)記輔助育種的研究始于90年代初，在過去的近十年時間里，取得了重要的研究進展：（1）構(gòu)建了水稻等作物的染色體遺傳圖譜；（2）構(gòu)建了水稻染色體物理圖譜；（3）利用分子標(biāo)記對我國作物種質(zhì)資源遺傳多樣性進行了初步研究；（4）對一些重要的農(nóng)藝性狀進行了定位、作圖與標(biāo)記，相應(yīng)的基因克隆已在進行[8]。就甜菜而言，在國外RFLP、RAPD、SSR和AFLP分子標(biāo)記已先后用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性檢測、品種（系）鑒別及重要農(nóng)藝性狀的分子標(biāo)記等方面的研究。然而開展甜菜高糖性、早熟性分子標(biāo)記在國內(nèi)還未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)報道，尤其是本次利用離子注入誘變產(chǎn)生的高糖、早熟突變體做親本進行分子標(biāo)記研究尚屬首次。

本實驗以離子注入誘變獲得的高糖突變體、早熟突變體和未經(jīng)誘變處理的對照為材料，構(gòu)建RAPD分子標(biāo)記相關(guān)指紋圖譜，為定位高糖、早熟性狀相關(guān)的基因或QTL和利用甜菜的高糖性、早熟性指導(dǎo)育種實踐，加快育種進程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甜菜優(yōu)良親本材料7208、離子注入誘變高糖體S10、早熟體W11。

1.2 方法

1.2.1 改良的SDS法 取甜菜葉片0.2g，同時把SDS提取液在65℃下預(yù)熱，然后進行甜菜葉片的研磨。在研樣中加500μL SDS提取液，之后裝入離心管中并在65℃水浴鍋下加熱30min，在加熱過程中，輕搖2～3次。取出，冷卻后加氯仿異戊醇500μL輕搖至勻，離心（12000r/min，15min）。取上清液，加氯仿異戊醇離心（8000r/min，10 min）。再取上清液，用無水乙醇沉淀靜置、離心（8000r/min，6min）。最后用70%乙醇洗2次，晾干，超純無菌水溶解放置（4℃）冰箱中備用。

1.2.2 PCR反應(yīng) ⑴RAPD反應(yīng)體系中的試劑及用量：Buffer 2.5μL，10M dNTPs 0.5μL，超純無菌水 14.1μL，Taq 酶 0.4μL，Mg2＋2.5μL， 模板 DNA 4μL， 引物 1μL。 ⑵PCR 擴增條件：95℃預(yù)變性 5min，94℃變性 1min，37℃復(fù)性 1min，72℃延伸 2min循環(huán) 44次，72℃再延伸 5min，4℃保存。

1.2.3 電泳及染色 采用瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，時間25 min。最后在Bio-Rad自動凝膠成像儀上觀察PCR結(jié)果。

1.2.4 帶型分析 以0、1為標(biāo)記，建立EXCEL分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫，0代表無條帶，1代表有條帶。

2 結(jié)果與分析

大量田間試驗表明：通過離子注入后所獲得的早熟性狀和含糖率高的性狀是穩(wěn)定遺傳的。因此本研究對其進行分子檢測，以期獲得與這些性狀緊密連鎖的標(biāo)記，并利用分子標(biāo)記來進行輔助選擇育種或研究種質(zhì)資源。

2.1 DNA的瓊脂糖電泳檢測

在已有工作基礎(chǔ)上總結(jié)出一種簡單，成本低廉，提取DNA效果又好的SDS方法。采用此方法提取效率較高，主帶明亮，整齊一致，降解現(xiàn)象不明顯。

2.2 RAPD體系的建立

甜菜優(yōu)良親本7208、離子注入高糖突變體S10和早熟突變體W11為材料，以離子注入誘變早熟體的RAPD分子標(biāo)記篩選為技術(shù)基礎(chǔ)[8]，根據(jù)其他作物的標(biāo)記體系進行整合后，建立了適于甜菜的RAPD分子標(biāo)記體系。

圖1 DNA檢測

圖2 RAPD檢測

此圖證實了用改良的SDS法提取DNA可以應(yīng)用到RAPD-PCR的擴增體系。在C1、T20、AE20、U15、C2、C11引物下離子注入誘變體與非離子注入誘變體的DNA條帶有差異，同時兩個離子注入誘變體S10、W11之間也存在差異。

2.2.1 多態(tài)性引物的確定 以 7208、S10、W11為材料，采用實驗室建立起來的RAPD分子標(biāo)記技術(shù)體系，從800條RAPD引物中篩選出擴增帶型有差異且?guī)颓逦€(wěn)定的引物。

表1 鑒定材料間差異的DNA多態(tài)性引物

從表1中看出有18個引物可以鑒別S10、7208之間的差異，也有18個引物可以鑒別W11、7208之間的差異。它們之間的引物并不是完全不同，V3、W5、C2、U15、AE20是它們共有的，占總引物的0.625%。有5個引物可以鑒別S10、W11之間的差異，占總引物的0.625%。由此可以證明雖然離子注入產(chǎn)生了高糖和早熟兩個變異體，但是它們之間的差異比較小，這主要是因為它們大部分遺傳物質(zhì)和親本7208相似。

2.2.2 帶型統(tǒng)計分析 以0、1為標(biāo)記，建立EXCEL分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫，0代表無條帶，1代表有條帶。

通過 7208、S10、W11的 RAPD 引物的篩選和特異性引物對應(yīng)的DNA指紋（見表2、3、4）統(tǒng)計，可以建立相應(yīng)的RAPD分子標(biāo)記指紋圖譜庫，同時也可以看出：用一個引物很難確定是哪種變異，因此確定某一種變異應(yīng)用多個引物的組合或指紋組合。

表2 引物所對應(yīng)的S10、7208的DNA指紋

表3 引物所對應(yīng)的W11、7208的DNA指紋

表4 引物所對應(yīng)的S10、W11的DNA指紋

3 討論

甜菜是兩年生作物，通過常規(guī)雜交轉(zhuǎn)育產(chǎn)生新的基因源，一則周期太長，二則在沒有基因來源的情況下，很難獲得新的創(chuàng)新材料。在甜菜理化誘變中，曾先后應(yīng)用航天、鈷60等誘變方法，但效果均不明顯。離子注入技術(shù)具有定向性、多樣性及安全性，有較高的突變譜。新疆在甜菜上利用離子注入技術(shù)獲得了創(chuàng)新早熟親本材料一份W11，含糖率增加的高糖親本一份S10，而且此種變異可以穩(wěn)定遺傳[8]。

隨機引物多態(tài)性DNA片斷可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD。盡管RAPD技術(shù)誕生的時間很短，但由于其獨特的檢測DNA多態(tài)性的方式具有快速、簡便的特點，使這個技術(shù)已滲透于基因組研究的各個方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，它是利用一系列不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈為引物，對所研究基因組DNA進行PCR擴增[13]。聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離，經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產(chǎn)物DNA片斷的多態(tài)性，這些擴增產(chǎn)物DNA片斷的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但對于任一特異的引物，它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點。這些特異的結(jié)合位點在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴增反應(yīng)的條件，即引物在模板的兩條鏈上有互補位置，且引物3’端相距在一定的長度范圍內(nèi)，就可以擴增出DNA片斷。因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片斷插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點分布發(fā)生相應(yīng)的變化，而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過對PCR產(chǎn)物檢測即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。分析時可用的引物數(shù)量很大，雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的，但是利用一系列引物則可以使檢測區(qū)域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態(tài)性檢測。另外，RAPD片斷克隆后可作為RFLP的分子標(biāo)記進行作圖分析。

由本實驗可知：利用RAPD檢測可以區(qū)分7208、W11、S10三者的差異并且通過分析也驗證了突變的低頻性。利用RAPD檢測可以區(qū)分7208、W11、S10三者的差異，正好和大田上三者之間存在有差異的結(jié)果是一致的，表明三者之間可能存在遺傳物質(zhì)上的差異。同時RAPD檢測可以較早地對甜菜的種子進行室內(nèi)檢測，從而更早地對誘變體進行選擇。但是用RAPD進行分子標(biāo)記，存在重復(fù)性差等局限性，因此為了彌補RAPD和大田檢測的局限性，還需要轉(zhuǎn)換一種SCAR的特異性的分子標(biāo)記技術(shù)來，更加準(zhǔn)確地鑒定出離子注入誘變產(chǎn)生的變異。

4 結(jié)論

本文通過RAPD分析得到了7208、W11、S10之間有差異的引物；通過帶型分析建立了7208、W11和S10的指紋圖譜庫。由實驗可知：利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)檢測了甜菜突變體，檢測差異的大小和大田檢測進行比對，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果是基本一致的，從而也證明了RAPD分子標(biāo)記技術(shù)是可以用于檢測生物的突變體的，因此用RAPD分子標(biāo)記對7208、W11、S10之間的差異進行監(jiān)測，在早代進行選擇，可以指導(dǎo)大田育種。再通過大田育種的結(jié)果來驗證分子育種的可行性，以確認(rèn)標(biāo)記的準(zhǔn)確性。

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