周 芹 ，許慶軒 ，吳玉梅 ，王佳鈺 ，趙艷麗

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；2.農(nóng)業(yè)部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，哈爾濱150080；3.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040；5.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，佳木斯154007）

各類化學(xué)除草劑是作物種植者降低用工成本，提高除草效率的主要除草方式。甜菜對某些除草劑十分敏感，玉米、大豆、小麥等是甜菜輪作種植中主要的前茬農(nóng)作物，莠去津、塞克津及2，4-D丁酯是上述作物生產(chǎn)中常用的除草劑，主要通過土壤前茬殘留和空氣飄移兩種形式危害甜菜。莠去津是玉米田的優(yōu)良除草劑[1]，塞克津可以在多種作物上應(yīng)用，莠去津和塞克津是在土壤中殘留的除草劑，每公頃用量超過4kg時(shí)，12個(gè)月內(nèi)不能種植甜菜[2]。筆者多年生產(chǎn)調(diào)查和小區(qū)試驗(yàn)表明[3]，除普斯特和豆磺隆外，塞克津、莠去津及2，4-D丁酯也是危害甜菜生長的除草劑。目前的除草劑檢測方法中多為同類除草劑的定量分析，采用氣相色譜-氮磷檢測器（GC-NPD）方法，可以測定土壤中塞克津、莠去津[4]，對于塞克津既有氣相色譜也有液相色譜法，但是對上述3種不同種類除草劑同時(shí)進(jìn)行分析的方法尚未見報(bào)道。

當(dāng)前氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）已成為鑒定天然及人工合成混合物組分的有效手段之一，逐漸被應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境農(nóng)藥污染的監(jiān)測研究[5]。本實(shí)驗(yàn)首先對氣相色譜（GC）分離條件和相關(guān)的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，通過總離子流色譜圖（TIC）中各峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖可以同時(shí)鑒定莠去津、塞克津、2，4-D丁酯3種目標(biāo)組分；利用3種組分的提取離子色譜圖（EIC）分別制定校正曲線，定量方法簡單。通過大量實(shí)驗(yàn)，對Florisil固相萃取小柱的萃取條件如洗脫溶劑等進(jìn)行了優(yōu)化，建立了GC-MS/MS方法同時(shí)測定土壤中均三氮苯類和酯類除草劑殘留的測定方法，是較為快捷的準(zhǔn)確定量方法，以期為建立甜菜質(zhì)量安全監(jiān)控量化指標(biāo)體系提供基礎(chǔ)資料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

美國瓦里安公司Varian450GC-320MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE300，KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，HY-6調(diào)速多用振蕩器，標(biāo)準(zhǔn)品莠去津、塞克津、2，4-D丁酯都是來自德國Dr.Ehrenstorfer公司，甲醇、正己烷、丙酮、乙腈均為色譜純。

1.1.1 色譜條件 進(jìn)樣口溫度Injector：200℃，載氣流速Flow Rate：2 mL/min，分流模式：采用脈沖分流，初始采用20∶1的分流比，0.01min關(guān)掉分流閥，2min時(shí)采用100∶1的分流比，4min時(shí)恢復(fù)初始分流比，柱溫箱采用程序升溫：70℃保持 2min，15℃/min升到 220℃保持 15min，1℃/min升至 225℃保持 1min，20℃/min升至290℃保持10min，傳輸線溫度Transfer Line250℃。

1.1.2 質(zhì)譜條件 離子源模式：Ionization EI，掃描時(shí)間Scan time：0.6，離子源溫度Ionization Temperature：200℃，數(shù)據(jù)采集延遲時(shí)間Collect Delay：4min。質(zhì)譜的MRM條件見表1。

?

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取莠去津、塞克津、2，4-D丁酯各0.0010g，分別定容于100mL容量瓶中，配制成10mg/L正己烷溶液，分別取出1mL溶液混合在一起，加入7mL正己烷溶液，制成1mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3 樣品提取與凈化

1.3.1 樣品的提取 取10.0g土壤樣品于200mL錐形瓶中，加入50mL丙酮∶正己烷（3∶2）混合溶劑，超聲30min，震蕩1h，8000r/min離心10min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，加10mL正己烷溶解，待用。

1.3.2 樣品的凈化 Florisil柱先用5mL丙酮∶正己烷（1∶9）活化，再用5mL正己烷活化，待液面剛剛接近柱填料表面時(shí)加入待洗脫液，棄去流出液，然后用10mL正己烷∶丙酮（9∶1）分兩次洗脫，接收洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸干，用1mL正己烷定容，過0.22μm濾膜，進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取和凈化方法的選擇

2.1.1 超聲次數(shù)和時(shí)間的考察 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道本實(shí)驗(yàn)采用兩種超聲方式，一種是重復(fù)超聲，即每次加入一定量溶劑，超聲20min，提取液離心，然后再重復(fù)這一步驟兩次，然后合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸干，用正己烷溶解，過SPE柱，再旋轉(zhuǎn)蒸干，定容。另一種方式是，一次性加入大量溶劑，超聲30min，再振搖1h，離心，旋轉(zhuǎn)蒸干，用正己烷溶解，過柱，再旋轉(zhuǎn)蒸干，定容。這兩種方法的回收率相差不大，分別是73%和70%，但是由于第一種方式費(fèi)時(shí)，消耗溶劑量大，所以選擇第二種方式進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.2 提取溶劑的選擇 莠去津、塞克津都屬于三嗪類除草劑，2，4-D丁酯屬于酯類除草劑，這兩類除草劑在性質(zhì)上存在較大的差異，為了能夠同時(shí)提取出這3種物質(zhì)并都有較高的回收率，本實(shí)驗(yàn)對提取的溶劑進(jìn)行了考察。結(jié)果見表2。

由表2可以看出丙酮∶正己烷為3∶2時(shí)3種除草劑的回收率都在合理范圍之內(nèi)，所以選擇丙酮∶正己烷（3∶2）作為提取溶劑。

2.1.3 SPE柱條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)的固相萃取柱為Florisil柱，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道采用丙酮∶正己烷（1∶9）活化，洗脫液是考察的主要對象，洗脫液應(yīng)選擇洗脫能力強(qiáng)，極性大的溶劑，F(xiàn)lorisil固相萃取柱為正相柱，上樣保留的是極性較大的物質(zhì)，洗脫時(shí)根據(jù)相似相容原理應(yīng)該采用極性大的溶劑將樣品從柱子上洗脫下來，具體步驟，①預(yù)淋洗：加入5 mL洗脫液（詳見表3），再加入5 mL正己烷。②上樣：分兩次加入10 mL加標(biāo)樣品，每次5mL。③洗脫：加入5 mL洗脫液，完全抽干后再加入5 mL洗脫液。

由表3中數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)正己烷∶丙酮（9∶1）時(shí)回收率最好，所以選擇洗脫液的混合比例為9∶1。

?

2.2 質(zhì)譜MRM定量條件的優(yōu)化及離子對的確定

串聯(lián)四極桿（MS/MS）分析可以將在色譜上不能完全分開的共流出物利用時(shí)間編程和多通道檢測將其分開。該技術(shù)不僅適用于復(fù)雜基體混合物的定性分析，而且可以利用得到二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行定量。這是因?yàn)樵趦蓚€(gè)前后串聯(lián)的質(zhì)譜/質(zhì)譜儀中，前級(jí)質(zhì)譜主要用于擔(dān)任分離工作，在樣品被電離后，它只允許被分析的目標(biāo)化合物的母離子或特征離子碎片通過，經(jīng)過碰撞裂解后，再由第二級(jí)質(zhì)譜分析裂解后產(chǎn)生的離子碎片，利用MS/MS可以同時(shí)得到較低的檢測限和良好的結(jié)構(gòu)鑒定信息（1個(gè)母離子和2個(gè)或更多的子離子）。

圖1 土嚷空白MRM掃描圖

圖2 莠去津、塞克津、2,4-D丁酯混標(biāo)MRM掃描總離子流圖

分別將莠去津，塞克津，2，4-D丁酯0.001‰標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，得到3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的氣-質(zhì)全掃描圖，以確定出峰時(shí)間。最后確定的保留時(shí)間為莠去津9.188min，2，4-D丁酯10.079min，塞克津10.146min。然后根據(jù)全掃描出來的色譜圖找到對應(yīng)的質(zhì)量數(shù)，莠去津215，塞克津198，2，4-D丁酯276，從而確定了這3種農(nóng)藥在質(zhì)譜中的質(zhì)量數(shù)，然后以這3個(gè)質(zhì)量數(shù)為母離子，分別掃描子離子，最后確定的離子對為莠去津215～200，2，4-D 丁酯 276～185，塞克津 198～82。 圖 1、2是這 3種除草劑的空白的及混標(biāo)MRM掃描總離子流圖。

?

2.3 精密度、線性范圍及檢出限

取0.03mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)樣檢測6次，以峰面積計(jì)算結(jié)果的變異系數(shù)（RSD）。由表4可知，莠去津，塞克津，2，4-D丁酯標(biāo)準(zhǔn)品檢測的RSD值較小，表明儀器方法的精密度良好。采用梯度稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.03、0.05、0.07 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按以上條件用儀器進(jìn)行檢測，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，3種三嗪類除草劑的線性范圍均在0.005～0.07 mg/L之間，相關(guān)系數(shù)都在0.999以上（圖3）。儀器的檢出限為0.5μg/kg，根據(jù)儀器的檢出限，為了能夠滿足土壤中3種除草劑檢測的要求，設(shè)計(jì)在對樣品進(jìn)行前處理的時(shí)候，將樣品濃縮5倍，得到方法的理論檢出限為 0.1 μg/kg。

?

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

向空白土壤中加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.015、0.03、0.06 mg/L，每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣，根據(jù)農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，農(nóng)藥殘留的回收率根據(jù)加標(biāo)濃度分類，加標(biāo)量在0.01～0.1 mg/L之間時(shí)，回收率在73%～104%之間。檢測結(jié)果如表5，各濃度平均回收率均在合理范圍內(nèi)，完全滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。

3 結(jié)論

3.1 首次用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)合測定土壤中不同種類除草劑莠去津、塞克津、2，4-D丁酯含量。首先對氣相色譜（GC）分離條件和相關(guān)的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，通過總離子流色譜圖（TIC）中各峰相應(yīng)的質(zhì)譜圖可以同時(shí)鑒定莠去津、塞克津、2，4-D丁酯3種目標(biāo)組分；3種組分的提取離子色譜圖（EIC）分別制定校正曲線，定量方法簡單。利用色譜的程序升溫及脈沖分流方法，3種除草劑得到很好的分離，同時(shí)，質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）與單獨(dú)用色譜比，具有較高的靈敏度和較低的檢出限。與分項(xiàng)單獨(dú)測定比較更經(jīng)濟(jì)和節(jié)省時(shí)間，是一種快捷準(zhǔn)確的聯(lián)合定量方法，可為甜菜質(zhì)量安全監(jiān)控提供基礎(chǔ)資料。

3.2 優(yōu)化了前處理方法，3種除草劑中，莠去津和塞克津均屬于三氮苯類除草劑，2，4-D丁酯屬于酯類除草劑，文獻(xiàn)報(bào)道中莠去津和塞克津可以用氣相色譜同時(shí)檢測，本文建立三種聯(lián)合檢測的前處理方法，樣品以丙酮∶正己烷3∶2作為提取溶劑提取，超聲30min，再振搖1h，離心，旋轉(zhuǎn)蒸干，用正己烷溶解，再經(jīng)Florisil固相萃取柱凈化后，旋轉(zhuǎn)蒸干，最后定容，上機(jī)測定，與單獨(dú)測定相比，節(jié)省了人力、物力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各濃度平均回收率均在合理范圍內(nèi)，此方法可以用于分析土壤中三嗪類和酯類除草劑殘留的測定。

[1]范潤珍.HPLC法測定土壤中莠去津殘留量方法的改進(jìn)[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2003，24（11）：14－16.

[2]夏樹有，畢景春.幾種常用化學(xué)除草劑對甜菜的危害[J].中國甜菜糖業(yè)，2001（3）：47－48.

[3]吳玉梅，周芹，許慶軒，等.北方農(nóng)田常用除草劑對甜菜安全生產(chǎn)影響初探[J].中國甜菜糖業(yè)，2011（3）：31－33.

[4]李衛(wèi)建，聶志強(qiáng)，蔡彥明，等.氣相色譜法同時(shí)測定土壤中13種三嗪類除草劑殘留量的方法研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（1）：211-215.

[5]劉偉，吳文君.氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)對嗪草酮原藥及其主要雜質(zhì)的分析[J].農(nóng)藥分析，2006，45（9）：614-615，617.