蘇明媛， 牛江龍， 李 林， 袁才根， 盧艷花*

(1.華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海，200237;2.聯(lián)合利華中國研究所，聯(lián)合利華研發(fā)中心(上海)，上海，200335)

川陳皮素(Nobiletin，5，6，7，8，3，4-hexamethoxy flavone)是從蕓香科柑桔屬橘子 Citrus reticulaia Blanco果皮中提取的一種黃酮化合物，按結構分類，它是一種多甲氧基黃酮類物質(zhì)［1］。目前已經(jīng)證實川陳皮素具有抗氧化［2-3］、抗炎［3］、抗腫瘤［2-4］、抗病毒［5］等多種生物活性，因此它的開發(fā)利用越來越受到人們的關注。本實驗旨在研究川陳皮素對多種腫瘤細胞生長的抑制作用及其可能的作用機制，以進一步揭示川陳皮素在抗腫瘤方面的活性及分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 96孔細胞培養(yǎng)板、6孔細胞培養(yǎng)板購自 Corning公司;流式細胞儀購自 Becton Dickinson公司;MK3酶標儀購自Thermo Labsystem公司;熒光顯微鏡購自德國徠卡儀器有限公司。

RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自 Gibco公司;小牛血清購自杭州四季青公司;Caspase-3分光光度法檢測試劑盒購于南京凱基生物公司;AV/PI雙染試劑盒購自Mbchemic生物公司;MTT、羅丹明123、DCFH-DA、Hochest33258均為 sigma公司產(chǎn)品;川陳皮素，純度＞98%，購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。陽性藥物阿霉素(Adriamycin，ADM)購自浙江海正藥業(yè)有限公司。其余試劑均為AR級。

1.2 細胞株及培養(yǎng)條件 Caco-2(人結腸癌細胞)、HeLa(人宮頸癌細胞)、HepG2(人肝癌細胞)、A375(人黑色素瘤細胞)，培養(yǎng)基為高糖的DMEM，添加10%小牛血清;SW1990(人胰腺癌細胞)，培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10%小牛血清。細胞置5%CO2培養(yǎng)箱，37℃，飽和濕度下培養(yǎng)，隔天換液1次。所有細胞均購自上海中科院細胞庫。

1.3 藥物配制 稱取16.1 mg川陳皮素，用1 mL的DMSO(二甲基亞砜)溶解，配制成40 mmol/L的貯備溶液。實驗時，以新鮮的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋貯備溶液至終濃度為0～400 μmol/L，并且使DMSO終嘗試小于0.1%?？瞻讓φ战M僅加入測試藥物所用溶媒DMSO(0.1%v/v)。稱取14.5 mg阿霉素，用5 mL雙蒸水溶解，配制成5 mmol/L的儲備溶液，過濾除菌。實驗時，以新鮮的DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋儲備溶液至終濃度0～16 μmol/L。

1.4 MTT法測定川陳皮素對5種腫瘤細胞的毒性取對數(shù)生長期的各細胞104cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，待細 胞培養(yǎng)6 h后，加入用新鮮培養(yǎng)基稀釋的不同濃度的川陳皮素100 μL處理，使其終濃度為0～200 μmol/L，化療藥物阿霉素作為陽性對照，每濃度平行5孔，對照組加等量體積的培養(yǎng)液(含0.1%v/vDMSO)，置 37 ℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，之后小心吸除上清培養(yǎng)基，每孔加入 0.5 mg/mL MTT100 μL(MTT 用培養(yǎng)基配制)，4 h后吸除上清液，每孔加入DMSO150 μL，振蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用酶標儀，以570 nm為實驗波長，630 nm為參照波長測定其吸光度值。分別計算川陳皮素及阿霉素對5種腫瘤細胞的毒性，確定半數(shù)細胞抑制濃度(IC50)。

半數(shù)胞毒的濃度(IC50)=細胞存活率達到一半時的藥物作用濃度

1.5 流式細胞儀檢測川陳皮素對HeLa細胞凋亡的影響 將HeLa細胞以106cells/mL接種于6孔板中，細胞培養(yǎng)6 h后，加入不同濃度的川陳皮素作用48 h;離心收集上清液中的細胞及貼壁細胞(2000 r/min，離心時間5 min)，棄培養(yǎng)基。用冷PBS洗滌細胞兩次;用400 μL Binding Buffer懸浮細胞，在細胞懸浮液中加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后于4℃避光條件下孵育15 min。然后加入10 μL PI，輕輕混勻，于4℃避光條件下孵育5 min;用流式細胞儀檢測(Ex:488 nm，Em:530 nm)。

1.6 Hochest 33258熒光染料法檢測細胞凋亡形態(tài)變化 將HeLa細胞以106cells/mL接種于6孔板中，細胞培養(yǎng)6 h后，加入不同濃度的川陳皮素作用48 h;之后吸除上清培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入固定液(甲醇-乙酸=3∶1)，4℃下固定10 min;吸除固定液，用PBS漂洗1次，加入終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的Hochest33258染液避光染色10 min后，用PBS漂洗1次，然后用90%甘油封固，以356 nm紫外光激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細胞的凋亡形態(tài)變化并拍照。

1.7 分光光度法檢測川陳皮素對HeLa細胞中凋亡蛋白酶Caspase-3活性的影響 將HeLa細胞以106cells/mL接種于6孔板中，細胞培養(yǎng)6 h后，加入不同濃度的川陳皮素作用48 h;離心收集上清液中的細胞及貼壁細胞，并用PBS洗滌2次;在收集的細胞中加入50 μL冰冷Lysis Buffer，吹打均勻，凍融2～3次;4℃下離心(1000 r/min)10 min;小心吸取上清(含裂解的蛋白質(zhì))轉移至新管中;吸取50 μL含100～200 μg蛋白的細胞裂解上清液，加入50 μL的2 ×Reaction Buffer及 5 μLCaspase-3 Substrate，于37℃避光孵育4 h;用酶標儀在405 nm下測定其吸光度值。

1.8 統(tǒng)計學處理 實驗結果以平均值±標準差表示。采用Origin8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 實驗結果

2.1 MTT法測定川陳皮素對5種腫瘤細胞的毒性川陳皮素對5種腫瘤細胞的細胞毒性實驗結果如圖1所示。由結果可知，川陳皮素對5種腫瘤細胞的生長都表現(xiàn)出一定的抑制作用，且呈劑量依賴關系。其中對人宮頸癌細胞HeLa的抑制效果最好，其IC50值為35.21 μmol/L。陽性對照藥阿霉素對5種腫瘤細胞作用48 h后表現(xiàn)出較好的抑制活性(見圖2)。

圖1 川陳皮素對5種腫瘤細胞的IC50值Fig.1 IC50values of nobiletin on five human cancer cell lines

圖2 阿霉素對5種腫瘤細胞的IC50值Fig.2 IC50values of ADM on five human cancer cell lines

2.2 AV/PI雙染檢測川陳皮素對HeLa細胞凋亡的影響 為了檢測川陳皮素對HeLa細胞的促凋亡作用，我們采用AV/PI雙染-流式細胞儀法檢測細胞凋亡。如圖3所示，空白對照組的凋亡率為10.21%，而細胞經(jīng) 17.5 μmol/L、35 μmol/L、70 μmol/L的川陳皮素處理48 h后，細胞凋亡率分別達到17.68%、24.85%、37.27%。表明川陳皮素對人宮頸癌HeLa細胞有良好的促凋亡作用，且隨濃度增大，藥物對HeLa細胞的促凋亡作用越強。

2.3 Hochest33258熒光染色觀察川陳皮素對HeLa細胞凋亡形態(tài)的影響 HeLa細胞經(jīng)川陳皮素處理48 h后，在熒光顯微鏡下觀察，356 nm處紫外光激發(fā)，可見典型的凋亡形態(tài)學變化(圖4B～D):核染色質(zhì)聚集、核固縮，出現(xiàn)凋亡小體等。且由結果可知，HeLa細胞的凋亡現(xiàn)象與川陳皮素濃度呈正比關系。而對照組的細胞核則呈現(xiàn)較均勻的藍色熒光(圖4A)。

圖3 川陳皮素對HeLa細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of nobiletin on apoptosis rate of HeLa cells

圖4 Hochest33258熒光染色結果(×200)Fig.4 The results of Hochest 33258 staining(×200)

2.4 Caspase-3活性測定 不同濃度的川陳皮素藥物組與對照組相比，測得的吸光度值有非常明顯的差別(P＜0.01)。隨著川陳皮素劑量的增加，吸光度值也隨之增加，見表1。實驗結果表明川陳皮素對細胞內(nèi)caspase-3活化程度呈劑量依賴性，即隨藥物濃度增加，細胞內(nèi)的凋亡蛋白酶增加。

表1 川陳皮素對人宮頸癌HeLa細胞內(nèi)凋亡蛋白酶caspase-3活性表達的影響(n=4，±s)Tab.1 Effect of nobiletin on caspase-3 activity in HeLa cells

表1 川陳皮素對人宮頸癌HeLa細胞內(nèi)凋亡蛋白酶caspase-3活性表達的影響(n=4，±s)Tab.1 Effect of nobiletin on caspase-3 activity in HeLa cells

與空白對照組比較，＊＊P ＜0.01。＊＊P ＜0.01 vs control group.

?

3 討論

癌癥是人類目前最難對付的頑癥之一，亦是世界醫(yī)學的一大難題。目前針對腫瘤的各種治療手段和抗癌化學藥物的應用都具有一定的危險性和毒副作用，因此，尋找一種使用安全、毒副作用小的純天然抗腫瘤藥物成為人們的焦點。眾多研究表明，從天然植物中提取的黃酮類化合物對多種腫瘤細胞具有良好的增殖抑制作用［6-8］。川陳皮素作為從柑橘果皮中提取的一種多甲氧基黃酮類物質(zhì)，已被證實具有抗腫瘤活性。本實驗分別考察了川陳皮素對Caco-2、HeLa、HepG2、A375、SW19905 種腫瘤細胞株的抑制作用，進一步揭示了川陳皮素在抗腫瘤方面的應用前景。

MTT比色法分析結果顯示川陳皮素對5種腫瘤細胞都表現(xiàn)出了一定的抑制作用，且抑制效果隨川陳皮素濃度的增加而增強，存在明顯的劑量依賴關系。其中，川陳皮素對人宮頸癌細胞HeLa的抑制效果最好，其半數(shù)致死濃度 IC5035.21 μmol/L，其次為人胰腺癌細胞 SW1990，其 IC50為75.37 μmol/L。川陳皮素的抑癌活性與化療藥物阿霉素相比，雖然略有差距，但是化療藥物具有高效高毒的特點，而川陳皮素作為從柑橘植物中提取的天然活性物質(zhì)，其表現(xiàn)出的高效抑癌活性，為進一步開發(fā)高效低毒的天然抗癌藥物提供了科學依據(jù)。

細胞凋亡普遍存在于生物界，對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生、組織內(nèi)正常細胞群的穩(wěn)定、機體的防御和免疫反應、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進展［9］起著重要作用 。在正常的細胞中，磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)位于細胞膜的內(nèi)側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35.8KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素FITC標記，利用流式細胞儀可檢測到細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(Propidine Iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞及死細胞區(qū)分開來［10］。Hochest33258是一種親核染料，可被活細胞攝取，Hochest33258染色可見凋亡細胞核致密、濃縮呈現(xiàn)強熒光團塊，而正常細胞核則呈均勻熒光［11］。通過 AV/PI雙染-流式細胞儀法及 Hochest33258熒光染色法對不同劑量川陳皮素處理后的HeLa細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)隨川陳皮素濃度增大，細胞的凋亡率隨之增大，凋亡形態(tài)學變化增多。說明川陳皮素可以明顯促進HeLa細胞的凋亡。

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，與DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體形成有關。Caspase-3在正常狀態(tài)下以酶原的形式存在于胞漿中，沒有活性;但在細胞發(fā)生凋亡階段，它被激活，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡［12］。本實驗利用分光光度法檢測不同濃度川陳皮素處理的HeLa細胞中Caspase-3的活性，結果顯示Caspase-3活性隨川陳皮素濃度的增加而增高。因此可以認為川陳皮素可能是通過活化凋亡蛋白酶Caspase-3進而誘導HeLa細胞凋亡的。

本實驗結果顯示，川陳皮素可對實驗中的5種腫瘤細胞產(chǎn)生抑制作用，并且川陳皮素誘導HeLa細胞的凋亡過程與凋亡調(diào)節(jié)蛋白酶Caspase-3的表達之間存在顯著相關性，但是川陳皮素在抗腫瘤過程中與其他凋亡蛋白酶及凋亡信號之間的關系還有待進一步的研究。

［1］Lu Yanhua，Zhang Chongwei，Bucheli P，et al.Citrus flavonoids in fruit and traditional Chinese medicinal food ingredients in China［J］.Plant Foods Hum Nutr，2006，61:57-65.

［2］Murakami A，Nakamura Y，Torikai K，et al.Inhibitory effect of citrus nobiletin on phorbol ester-induced skin inflammation，oxidative stress，and tumor promotion in mice［J］.Cancer Res，2000，60:5059-5066.

［3］Lina N，Satoa T，Takayamaa Y，et al.Novel anti-inflammatory actions of nobiletin，a citrus polymethoxy flavonoid，on human synovial fibroblasts and mouse macrophages［J］.Biochem Pharmacol，2003，65(12):2065-2071.

［4］Luo Gang，Guan Xiaoling，Zhou Liming.Apoptotic effect of citrus fruit extract nobiletin on lung cancer cell line A549 in vitro and in vivo［J］.Cancer Biol Ther，2008，7(6):966-973.

［5］Iwasea Y，Takemuraa Y，Ju-ichia M，et al.Inhibitory effect of flavonoid derivatives on Epstein-Barr virus activation and twostage carcinogenesis of skin tumors［J］.Cancer Lett，2001，173(2):105-109.

［6］YeB，Aponte M，Dai Y，et al.Ginkgo biloba and ovarian cancer prevention:epidemiological and biological evidence［J］.Cancer Lett，2007，251(1):43-52.

［7］Lu Yanhua，Ye Chunlin，Liu Jianwen，et al.In vitro anti-tumor activity of 72’，4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’，5’-dimethylchalcone against six established human cancer cell lines［J］.Pharmacol Res，2004，50:505-510 .

［8］Choi S U，Ryu S Y，Yoon S K，et al.Effects of flavonoids on the growth and cell cycle of cancer cells［J］.Anticancer Res，1999，19(6B):5229-5233.

［9］Evans G I，Vousden K H.Proliferation，cell cycle and apoptosis in cancer［J］.Nature，2001，411(6835):342-348.

［10］Verma M，Singh S.K，Bhushan S，et al.In vitro cytotoxic potential of polyalthia longifolia on human cancer cell lines and induction of apoptosis through mitochondrial-dependent pathway in HL60 cells［J］.Chem-Biol Interact，2008，171:45 – 56.

［11］NaritaY，Asai A，Kuchino Y，et al.Actinomycin D and staurosporine，potent apoptosis inducers in vitro，are potentially effective chemotherapeutic agents against glioblastoma multiforme［J］.Cancer Chemoth Pharm，2000，45:149-156.

［12］Cheung H H，Lynn Kelly N，Liston P，et al，Involvement of caspase-2 and caspase-9 in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis:a role for the IAPs，Exp［J］.Cell Res.2006，312:2347–2357.