戴啟剛， 詹秀琴

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210046;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210046)

現(xiàn)代膜分離技術(shù)(membrane separation technology，MST)以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，以膜孔徑大小為特征，在推動力(如壓力差、濃度差、電位差等)驅(qū)使下，原料側(cè)組分選擇性地通過膜，以達(dá)到分離、提純的目的［1］，其產(chǎn)物或是單一成分，或是某一分子量區(qū)段的多種成分，能有效地分離提純同一活性組分群。因其具有節(jié)能、高效、無相變化、操作方便、無二次污染、操作溫度低等優(yōu)點，在中藥尤其是主要活性成分為熱敏性蛋白的動物藥的分離純化中有廣泛的應(yīng)用前景。MST所用膜有多種材質(zhì)，在中藥有效成分分離中常用膜材料主要是無機膜、高分子有機膜(如聚偏氟乙烯 polyvinylidenefluoride，PVDF)［2］。其中PVDF是一種新興的、綜合性能優(yōu)良的膜材料，機械強度高，耐酸堿等苛刻環(huán)境條件和化學(xué)穩(wěn)定性好，是超濾和微濾的常用膜材料;而無機陶瓷膜具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性和良好的機械強度，在中藥體系的應(yīng)用中突出優(yōu)點在于其抗污染性能強，對藥液的前處理要求不高，膜可以反復(fù)再生，操作過程穩(wěn)定，常用的是三氧化二鋁(Al2O3)和氧化鋯(ZrO2)膜管。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)［3］，動物藥地龍(Pheretima)活性成分多元化，具有抗凝、溶栓、抑制血小板聚集、抗癌、平喘、抗氧化等活性作用。本實驗根據(jù)動物類中藥地龍的主要有效成分為蛋白多肽類物質(zhì)，如蚯蚓纖溶酶、蚓激酶等，分子量多在10000～100000之間，且其分子量分布與藥效作用有密切相關(guān)性的基本原理，選擇PVDF、無機Al2O3及ZrO2陶瓷膜管對地龍勻漿液有效組分進(jìn)行分級分離提純，精制出多個具有不同分子量分布特征的地龍活性組分群，根據(jù)所測各分離液中活性組分的蛋白含量、分子量分布、纖溶活性，比較兩種膜分離提純地龍勻漿液有效組分的優(yōu)劣，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)分離提純地龍勻漿液有效組分提供技術(shù)支持。

1 實驗材料和設(shè)備

1.1 實驗材料 鮮地龍:品種為赤子愛勝蚓(Eisenia foetide)，購于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖場;考馬斯亮藍(lán)G-250、R-250(美國 AMRESCO公司生產(chǎn)，進(jìn)口分裝);牛血清白蛋白(BSA)、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(為6種蛋白質(zhì)的混合體，分別為卵清溶菌酶14400、胰蛋白酶抑制劑20100、牛碳酸酐酶31000、兔肌動蛋白酶43000、牛血清清蛋白66200、兔磷酸化酶97400)(上海伯奧生物科技有限公司產(chǎn)品);牛纖維蛋白原、凝血酶原、纖溶酶原、尿激酶均購于江蘇省藥品生物制品檢驗所;瓊脂糖(BDH進(jìn)口分裝);其他試劑均為國產(chǎn)或者Sigma分析純。

聚偏氟乙烯膜(PVDF):截留分子量(MWCO)為 10000、50000、100000，購于上海應(yīng)用物理研究所;膜管:0.2 μm Al2O3、50 nm ZrO2無機陶瓷膜管，均購于南京工業(yè)大學(xué)膜科學(xué)技術(shù)研究所，所有膜管外徑12 mm，內(nèi)徑8 mm，長20 cm，有效濾過面積為0.005 m2。

1.2 實驗儀器設(shè)備 XHF-1內(nèi)切式勻漿器，購于浙江寧波新芝科學(xué)儀器研究所;臺式高速冷凍離心機:TGL-16M型，長沙湘儀離心機儀器有限公司生產(chǎn);DYY-Ⅲ713型電泳槽、DYY-4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、WD-9405B型脫色搖床，均購自北京六一儀器廠;37℃恒溫水浴箱;打孔器;玻璃平板(9 cm×9 cm);721分光光度計，上海分析儀器廠生產(chǎn);37度恒溫水浴鍋;臺式離心機;微量式移液槍。

SCM超濾杯:膜有效過濾面積為3.32×10－3m2，購于上海應(yīng)用物理研究所新技術(shù)中心;微型無機陶瓷微濾膜裝置，南京化工大學(xué)膜科學(xué)技術(shù)研究所研制。實驗裝置如圖1。

圖1 實驗裝置流程圖Fig.1 Experimental process diagram

2 實驗方法

2.1 過膜操作 取一定量的地龍，加入3倍量的二次蒸餾水，勻漿10 min，11000 r/min ×20 min、10 ℃離心，取地龍上清液置于4℃冰箱冷藏備用。

SCM超濾杯過膜分離過程:取100 mL地龍上清液，在最優(yōu)操作條件下即 0.25 MPa，30 °C，200 r/min，pH 為 6.7，地龍濃度為 33.3%(w:w)(本課題組已發(fā)表相關(guān)論文［4］)依次過膜材料孔徑(MWCO)為100000、50000、10000超濾膜進(jìn)行分級過濾。即上清液先用MWCO 100000超濾膜進(jìn)行過濾，當(dāng)濾過液為80 mL時，往杯內(nèi)截留液中加入10 mL雙蒸水，繼續(xù)超濾，至濾過液體積為約100 mL時停止。截留液保留備用，100 mL濾過液在清洗超濾杯后用MWCO 50000超濾膜進(jìn)行過膜分離。依法分離，收集每一級濾過液和截留液，備用。

無機陶瓷微濾膜膜分離過程:取一定量地龍上清液，在0.15 MPa，50 ℃，33.3%的最佳操作條件下(本課題組已發(fā)表相關(guān)論文［5］)先后用 0.2 μm Al2O3、50 nm ZrO2無機陶瓷膜管對地龍勻漿液進(jìn)行分級分離，方法如PVDF膜分離，收集每一級的濾過液和截留液，備用。

2.2 蛋白濃度的測定 采用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定各級濾過液和截留液蛋白質(zhì)的量。按照文獻(xiàn)［6］方法，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用0.15 mol/L NaCl將其做梯度稀釋成 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 液，加入考馬斯亮藍(lán)G-250，在595 nm處讀取吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可計算出樣品的蛋白濃度。

2.3 分子量分布測定 采用十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定樣品中活性蛋白的分子量范圍和量大小。按照文獻(xiàn)［7］方法，采用5%濃縮膠、12%分離膠。

2.4 纖溶活性檢測 按Astrup法［8］制備纖維蛋白平板:將平板(9 cm×9 cm)放在水平儀上調(diào)至水平，用1倍pH7.2 PBS溶液配制1%的瓊脂糖，取5 mL 65℃恒溫，另取等體積緩沖液5 mL，在37℃恒溫箱中保溫，加入1/4支纖維蛋白原和10U凝血酶，終質(zhì)量濃度為3 mg/mL，兩種溶液迅速混勻，趁熱倒入平板中，將氣泡趕至邊緣，室溫下凝固，用外徑6 mm的打孔器打孔(數(shù)目按需要定)。分別在孔中加入20 μL不同濃度的尿激酶、待測樣品，37℃恒溫水浴5 h后測溶圈兩相互垂直的直徑。重復(fù)3次。

3 實驗結(jié)果及討論

3.1 蛋白濃度的測定

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 據(jù)表1的數(shù)據(jù)以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)、OD595nm值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白OD595 nm值Tab.1 OD595 nmof standard protein BSA

分析標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，蛋白量與光密度成線性關(guān)系，OD595nm值=0.56×標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA濃度，可根據(jù)光密度計算出樣品的蛋白量。

3.1.2 各樣品中的蛋白量及討論 根據(jù)光密度值，測定膜分級過濾所得濾液蛋白量變化如表2及蛋白濃度見表3。

表2 過膜前后蛋白量變化Tab.2 Change of protein level after membrane separation

表3 樣品液蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)Tab.3 Concentration of protein in sample solution(mg/mL)

由表2、3可見，PVDF10萬膜截留前后液中蛋白濃度相差不大，且膜蛋白截留率較小，能將大分子蛋白截留，允許小分子蛋白通過，因此有利于后面的分級分離;5萬膜二級分離時截留液中蛋白量遠(yuǎn)高于濾過液，截留率高，說明其截留效果最好，能制備高濃度的地龍蛋白液，但同時又會因蛋白吸附在膜表面形成濾餅層及膜孔阻塞造成膜污染嚴(yán)重，把分子量小于50000的蛋白質(zhì)也截留了下來;1萬膜的截留率小，這是因為三級分離時，液體中的蛋白質(zhì)量已減少，且大多數(shù)是分子量較小的蛋白和多肽，蛋白質(zhì)通過率高，但對分子量10000的蛋白質(zhì)能有效截留純化。

圖2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.2 SDS-PAGE of Samples

無機陶瓷膜用0.2 μm Al2O3管分離時，截留液和濾過液中的蛋白含量相差很大，膜的截留率為49.3%，且蛋白丟失率達(dá)48.7%。無機膜二級分離用50 nm ZrO2膜管，截留液和濾過液中的蛋白量存在差別，且膜的截留率高、蛋白丟失率小，這說明經(jīng)一級Al2O3膜管處理后的液體再用ZrO2膜管，能將活性蛋白截留濃縮，另外該級膜分離時蛋白質(zhì)丟失少。

3.2 分子量分布測定 圖2A中可見10萬膜截留液中對應(yīng)位置在26000以上的蛋白條帶和勻漿液幾乎一致但條帶淺，說明它能允許較多的小分子蛋白通過膜。而5萬膜截留液中蛋白量大且種類多，能將較多蛋白截留濃縮。1萬膜截留液中分子量在31000以下有一條帶，說明其對這一分子量的蛋白質(zhì)能有效截留。

圖2B中發(fā)現(xiàn)，地龍勻漿液主要活性蛋白分子量分布在 10000 ～100000。勻漿液、0.2 μm Al2O3截留液的蛋白條帶所處位置幾乎一致，但后者蛋白條帶染色深，蛋白量大，這說明0.2 μm Al2O3管能將勻漿液中的蛋白有效截留濃縮，分子量在26000左右的含量尤其高，26000以下分子量的蛋白比較少，說明其截留的主要是分子量不小于26000的蛋白質(zhì)。50 nm ZrO2濾過液中分子量在20100以下的蛋白量較高。這說明用無機膜分離地龍勻漿液精制活性成分，一級0.2 μm Al2O3膜管純化效果差，但用二級膜管分離可以得到某一分子量范圍的活性組分群。

3.3 纖溶活性測定

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 用20 μL濃度分別為20、40、60、80、100 U/mL 的尿激酶點樣，測定溶圈的兩個互相垂直的直徑，兩直徑乘積減去孔直徑(6 mm)平方即為溶圈面積，以尿激酶濃度為橫坐標(biāo)、溶圈面積為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果見表4。

表4 尿激酶纖溶活性測定Tab.4 Determination of fibrinolytic activity of urokinase

分析標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，溶圈面積=－35.56+1.75×尿激酶濃度。表明當(dāng)尿激酶濃度大于20 U/mL時，溶圈面積和尿激酶的濃度成線性關(guān)系。本方法靈敏可靠，可以通過比較溶圈面積的大小來判定纖溶作用的強弱。

3.3.2 分級分離樣品的纖溶活性測定 分別將膜分離的樣品點樣在纖維蛋白平板孔中，測定溶圈的兩個互相垂直的直徑，并計算兩者的乘積，兩者的乘積減去孔直徑平方即為溶圈的面積，可用來反映樣品的纖溶活性。結(jié)果見圖3、表5。

從表中可以看出，PVDF 5萬膜截留液的蛋白量最多，溶圈面積最大，說明5萬膜基本上能將有纖溶活性的蛋白質(zhì)截留濃縮，有利于對地龍勻漿液有效成分的分離;10萬膜分離時，截留液和濾過液蛋白量、溶圈面積差別不大;而用無機陶瓷膜0.2 μm Al2O3分離，則蛋白量低，溶圈面積小，纖溶活性小。至于PVDF 1萬膜和50 nm ZrO2二級無機膜濾過剛截留液和濾過液同樣存在著蛋白量低，溶圈面積小，纖溶活性低，不利于得到高濃度高纖溶活性的蛋白截留提純物。

圖3 膜分離物的纖溶活性Fig.3 Fibrinolytic activity determination of products of membrane separation

表5 分離物的纖溶活性測定Tab.5 Fibrinolytic activity determination of products of membrane separation

4 結(jié)論

通過對地龍分級分離物的蛋白含量測定、分子量分布測定、纖溶活性測定，結(jié)果顯示:有機膜PVDF對地龍勻漿液的分離純化效果較好，MWCO 50，000膜分離能得到具有較大纖溶活性蛋白組分群;無機0.2 μm Al2O3陶瓷膜不適合分離蛋白量較多的地龍勻漿液，但50 nm ZrO2能對經(jīng)過0.2 μm Al2O3處理的濾過液進(jìn)行一定程度的有效分離純化。因此，PVDF可用來對地龍勻漿液分離純化，其效果好于無機陶瓷膜。

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