莫雋穎，陶 冶，周佳佳，高黎榮，付水林，宮 衡

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實驗室，上海 200237)

目前，克雷伯氏肺炎桿菌基因敲除的相關(guān)研究多為利用oriR6K型自殺質(zhì)粒的傳統(tǒng)敲除方法[1～4]，其實驗周期較長，且整合到受體菌株基因組上的抗性標(biāo)記無法去除，不適用于多基因突變的研究。

Datsenko等[5]構(gòu)建了一套適用于E.coliK-12菌株靶基因快速敲除的Red重組質(zhì)粒系統(tǒng)。該系統(tǒng)需要3類質(zhì)粒，分別是：表達(dá)Exo、Beta、Gam蛋白的協(xié)助同源重組質(zhì)粒pKD46、pKD20等；兩側(cè)含F(xiàn)RT位點(diǎn)的抗性基因的質(zhì)粒pKD3、pKD4、pKD13；受誘導(dǎo)表達(dá)FLP重組酶以消除基因組上同源重組抗性基因的質(zhì)粒pCP20。利用Red重組質(zhì)粒系統(tǒng)敲除靶基因的主要流程是：(1)以pKD3/pKD4為模板，設(shè)計含40～60 bp靶基因的同源序列引物，PCR擴(kuò)增含F(xiàn)RT位點(diǎn)的抗性基因(打靶片段)；(2)將打靶片段轉(zhuǎn)化到已表達(dá)Red重組酶的宿主中，抗性篩選陽性克??；(3)將pCP20導(dǎo)入篩選出的重組子中，誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá)，移除抗性標(biāo)記。Red重組質(zhì)粒系統(tǒng)已被證實也能在其它一些菌株中有效地敲除靶基因[6，7]，但目前尚沒有Red重組系統(tǒng)在克雷伯氏肺炎桿菌中應(yīng)用的報道。作者在此以莢膜基因wzi作為敲除對象[8，9]，研究了Red重組系統(tǒng)在克雷伯氏肺炎桿菌中的敲除效果。

1 實驗

1.1 菌株與質(zhì)粒

K.pneumoniae，自行篩選。

E.coliDH5α、 pKD46、 pKD4、 pCP20，自行保存；載體pMD18T、質(zhì)粒pBR322，TaKaRa公司。

1.2 限制性內(nèi)切酶與主要試劑

XmnⅠ限制性內(nèi)切酶，F(xiàn)ermentas公司；T4連接酶、DL 10 000TMDNA Marker，TaKaRa公司；2×TaqPCR MasterMix、2×TaqPlus PCR MasterMix、DNA MarkerⅢ、細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，北京天根公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)、電轉(zhuǎn)化及PCR方法

參見《分子克隆》。

1.4 引物設(shè)計

實驗所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，見表1。

表1 實驗中所用的引物

1.5 適用于克雷伯氏肺炎桿菌的Red重組系統(tǒng)的構(gòu)建

由于K.pneumoniae菌株本身含有Amp抗性，故pKD46與pCP20質(zhì)粒不能直接用于該菌株的基因敲除實驗，需要對其改造。通過序列查找發(fā)現(xiàn)這兩個質(zhì)粒的Amp抗性基因上有一個XmnⅠ限制性酶切位點(diǎn)，且整個質(zhì)粒中該位點(diǎn)只有一個[10]，在該位置插入其它抗性基因可以使這兩個質(zhì)粒具有新的抗性標(biāo)記，同時去除了Amp抗性標(biāo)記。構(gòu)建方案見圖1。

圖1 pKD46-Tc和 pCP20-Tc的構(gòu)建

首先擴(kuò)增適合的抗性基因。以pBR322質(zhì)粒為模板，設(shè)計其四環(huán)素抗性基因的引物F-tet和R-tet，兩端加上XmnⅠ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增tet基因，膠回收tet片段，連到pMD18 T載體后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂LB平板(含鹽酸四環(huán)素20 μg·mL-1)，37 ℃過夜培養(yǎng)12～16 h；次日挑取單克隆擴(kuò)增后抽質(zhì)粒，用XmnⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒tet-pMD18T。

用T4連接酶將片段tet分別與同樣經(jīng)XmnⅠ酶切的pKD46和pCP20 連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂LB平板(含鹽酸四環(huán)素20 μg·mL-1)，30 ℃過夜培養(yǎng)16～20 h，挑取單克隆擴(kuò)增后抽質(zhì)粒，用XmnⅠ酶切鑒定重組質(zhì)粒pKD46-Tc和pCP20-Tc。

將pKD46-Tc轉(zhuǎn)化到K.pneumoniae菌株中，涂LB平板(含鹽酸四環(huán)素20 μg·mL-1)，30 ℃培養(yǎng)過夜，得到的K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株陽性克隆，根據(jù)pKD46質(zhì)粒上exo-bet-gam基因設(shè)計引物F-46和R-46，進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.6 二步PCR法擴(kuò)增片段△wzi：：FK

由于直接合成同源臂的成本較高且長度有限，故采用二步PCR的方法來擴(kuò)增得到重組片段[6]。以pKD4質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物F-FRT和R-FRT，擴(kuò)增兩端含F(xiàn)RT位點(diǎn)的kan抗性基因片段FK(約1500 bp)。確定同源臂為250 bp，設(shè)計wzi片段的上游250 bp序列的兩端引物Fup-wzi和Rup-wzi：：FRT，反向引物的5′端加入F-FRT的序列，wzi片段下游250 bp序列的兩端引物Fdown-FRT：：wzi和Rdown-wzi，正向引物的5′端加入R-FRT的序列，以wzi-pMD18T為模板擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增得到的3個片段up-wzi、down-wzi、FK按物質(zhì)的量比1∶1∶1混合作為模板，以Fup-wzi和Rdown-wzi為引物，擴(kuò)增片段△wzi：：FK(1981 bp)。

1.7 wzi基因缺失陽性重組子的獲得

制備K.pneumoniae/pKD46-Tc電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，加20 mmol·L-1L-阿拉伯糖，30 ℃誘導(dǎo)Red重組酶表達(dá)2.5 h。電轉(zhuǎn)化體系為5 μL △wzi：：FK片段+100 μLK.pneumoniae/pKD46-Tc感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化條件2500 V、5～6 ms，轉(zhuǎn)化后涂LB板(含卡那霉素20 μg·mL-1)，37 ℃過夜培養(yǎng)。以wzi上下游外側(cè)的序列設(shè)計重組子鑒定引物Fupout-wzi和Rdownout-wzi，菌落PCR鑒定基因敲除的效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒tet-pMD18T的構(gòu)建

tet基因的PCR產(chǎn)物及tet-pMD18T的XmnⅠ酶切片段見圖2。

1.tet基因的PCR產(chǎn)物 2、3.tet-pMD18T的XmnⅠ酶切片段M.DNA MarkerⅢ

由圖2可看出，重組質(zhì)粒tet-pMD18T的酶切片段有3個。這是因為，pMD18T質(zhì)粒本身含有一個XmnⅠ酶切位點(diǎn)，中間那條1300 bp左右的片段為tet片段。

2.2 重組質(zhì)粒pKD46-Tc與pCP20-Tc的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pKD46-Tc和pCP20-Tc的酶切鑒定結(jié)果見圖3。

1.pKD46-Tc digested by XmnⅠ 2.pCP20-Tc digested by XmnⅠ 3.pKD46-Tc plasmid 4.pCP20-Tc plasmid M1.DL 10 000TM DNA Marker M2.DNA MarkerⅢ

在圖3中2000～1000 bp的位置能看到一條目的片段。由于重組質(zhì)粒pKD46-Tc和pCP20-Tc是低拷貝質(zhì)粒，量較少，所以酶切的片段不是太明顯。由于克隆的是Tc抗性基因，菌體能在Tc抗性的培養(yǎng)基中生長，表明該基因已成功表達(dá)，故不測序。

2.3 K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株的篩選(圖4)

1～11.the 11 monoclones 12.pKD46-Tc plasmid(positive) 13.K.pneumoniae(negative) M.DNA MarkerⅢ

由圖4可以看出，1#～10#陽性克隆均有相似大小的條帶，11#克隆沒有條帶，12#陽性對照有明顯的目的片段(1922 bp)，13#陰性對照無條帶。表明1#～10#均轉(zhuǎn)入了pKD46-Tc，得到了K.pneumoniae/pKD46-Tc菌株。

2.4 二步PCR法擴(kuò)增片段△wzi：：FK(圖5)

1.up-wzi 2.down-wzi 3～12.退火溫度(℃)：45、46.2、47.4、50.2、53.1、40、44、48.8、51.2、53.6 M.DNA MarkerⅢ

由圖5a可以看出，up-wzi和down-wzi片段的大小在250 bp左右處，與理論位置相符。由圖5b可以看出，在1500 bp左右有明顯的條帶，應(yīng)為FK片段，且隨退火溫度的升高條帶亮度逐漸增強(qiáng)。估算up-wzi濃度約為60 ng·μL-1、down-wzi濃度約為20 ng·μL-1、FK濃度約為10 ng·μL-1。由圖5c可以看出，除了目的條帶△wzi：：FK(1981 bp)外還有一些非特異條帶。膠回收圖中2000 bp左右的條帶，考慮到以此條帶為模板PCR擴(kuò)增的效果不好，存在較多非特異性條帶，擴(kuò)增前需要將該片段與T載體相連進(jìn)行亞克隆。

2.5 wzi基因缺失重組子的鑒定

卡那霉素抗性平板上長出9個克隆，用引物Fupout-wzi和Rdownout-wzi PCR鑒定，結(jié)果見圖6。

1～9.陽性克隆 10.K.pneumoniae genome DNA(未敲除的基因?qū)φ? 11.ddH2O(陰性對照) M.DNA MarkerⅢ

未敲除的原始序列PCR產(chǎn)物應(yīng)該在1500 bp左右的位置，理論上重組子PCR產(chǎn)物應(yīng)該在2000 bp左右的位置。由圖6可以初步確定9個克隆中有6個是wzi基因敲除的重組子，其余3個克隆為假陽性。

3 結(jié)論

通過構(gòu)建含四環(huán)素抗性標(biāo)記的重組質(zhì)粒pKD46-Tc和pCP20-Tc，建立了一套能在K.pneumoniae菌株中運(yùn)用的Red重組系統(tǒng)，以莢膜基因中的高保守wzi基因為敲除對象，導(dǎo)入同源臂為250 bp的打靶片段Δwzi：：FK，轉(zhuǎn)化后得到6個重組子，通過菌落PCR鑒定初步確定敲除了K.pneumoniae菌株的wzi基因。在后續(xù)的研究中，需要利用pCP20-Tc質(zhì)粒表達(dá)FLP重組酶將抗性篩選標(biāo)記去除，得到不含抗性基因的基因敲除重組子，并且對wzi基因缺失株的莢膜表達(dá)進(jìn)行鑒定，分析wzi基因缺失對莢膜多糖合成的影響。Red重組系統(tǒng)的建立為后續(xù)K.pneumoniae菌株代謝途徑有關(guān)基因突變株的構(gòu)建奠定了一定基礎(chǔ)。

[1] Fadeeva M S，Yakovtseva E A，Belevich G A，et al.Regulation of expression of Na+-translocating NADH：Quinone oxidoreductase genes inVibrioharveyiandKlebsiellapneumoniae[J].Archives of Microbiology，2007,188(4)：341-348.

[2] Bertsova Y V，Bogachev A V.The origin of the sodium-dependent NADH oxidation by the respiratory chain ofKlebsiellapneumoniae[J].FEBS Letters，2004，563(1)：207-212.

[3] Yang G，Tian J，Li J.Fermentation of 1，3-propanediol by a lactate deficient mutant ofKlebsiellaoxytocaunder microaerobic conditions[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2007，73(5)：1017-1024.

[4] Balestrino D，Haagensen J A J，Rich C，et al.Characterization of type 2 quorum sensing inKlebsiellapneumoniaeand relationship with biofilm formation[J].Journal of Bacteriology，2005，187(8)：2870-2880.

[5] Datsenko K A，Wanner B L.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97(12)：6640-6645.

[6] Yamamoto S，Izumiya H，Morita M，et al.Application of λ Red recombination system toVibriocholeraegenetics：Simple methods for inactivation and modification of chromosomal genes[J].Gene，2009，438(1-2)：57-64.

[7] Lesic B，Rahme L G.Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants inPseudomonasaeruginosa[J].BMC Molecular Biology，2008，9(1)：20.

[8] Fang C T，Lai S Y，Yi W C，et al.Klebsiellapneumoniaegenotype K1：An emerging pathogen that causes septic ocular or central nervous system complications from pyogenic liver abscess[J].Clinical Infectious Diseases，2007，45(3)：284-293.

[9] Arakawa Y，Wacharotayankun R，Nagatsuka T，et al.Genomic organization of theKlebsiellapneumoniaecps region responsible for serotype K2 capsular polysaccharide synthesis in the virulent strain Chedid[J].Journal of Bacteriology，1995，177(7)：1788-1796.

[10] Doublet B，Douard G，Targant H，et al.Antibiotic marker modifications of λ Red and FLP helper plasmids，pKD46 and pCP20，for inactivation of chromosomal genes using PCR products in multidrug-resistant strains[J].Journal of Microbiological Methods，2008，75(2)：359-361.