朱 逸，貢 力，鈕洪艷

徐州醫(yī)學院附屬淮安市第二人民醫(yī)院心胸外科，江蘇淮安 223002

近幾十年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率不斷升高。在1998～2002年，肺癌的發(fā)病率和死亡率在我國大多數(shù)地區(qū)居惡性腫瘤的首位[1]；而在2002年肺癌的新病例和死亡人數(shù)在全世界也居惡性腫瘤首位[2]。肺癌的病理分型出現(xiàn)腺癌比例增加的趨勢。在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)進行選擇性降解的重要途徑之一是泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin proteasome pathway，簡稱UPP通路），它在調(diào)節(jié)細胞凋亡過程中的作用非常重要[3-4]，在研究UPP在細胞凋亡中的作用時，蛋白酶體抑制劑（MG132）的應用為我們提供了有力的手段。有研究表明，蛋白酶體抑制劑能夠誘導多種人腫瘤細胞的凋亡是通過阻斷泛素化通路而實現(xiàn)，但其具體作用機制到目前仍未被闡明[5-6]。該研究應用體外培養(yǎng)的人肺腺癌細胞株A549，并且給予不同濃度的MG132處理，觀察其對A549細胞凋亡率的影響，以及細胞內(nèi)Bcl-2和Bad蛋白表達水平的變化。探討MG132調(diào)控A549細胞凋亡的可能機制，為進一步研究MG132誘導A549凋亡的機制和其他類型肺癌以及其他腫瘤的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 A549細胞和試劑

人肺腺癌細胞株A549購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。新生牛血清（NBS，杭州四季青生物工程材料研究所）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco公司）；AnnexinVFITC/PI凋亡試劑盒（上海博蘊生物試劑有限公司）；MG132、一抗 Bcl-2 和 Bad、MTT（Sigma公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

將A549細胞常規(guī)復蘇后，以RPMI-1640培養(yǎng)液加10%NBS培養(yǎng)，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞傳2～3代后按照需要接種于不同培養(yǎng)板中，當細胞融合密度約70%時，換無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，MG132在給藥前應用RPMI-1640培養(yǎng)液現(xiàn)配。并且進一步稀釋使其在培養(yǎng)液中的終濃度為：0、5、10、20、40 μmol/L，并設空白對照組（不做任何處理）。培養(yǎng)24 h，檢測相關(guān)指標。

1.3 MTT比色法檢測細胞存活率

細胞按照需要接種于96孔板，處理方法同“1.2”所述，將培養(yǎng)24 h后的每組細胞，每孔中加入MTT 20 μl（PBS配制、5 g/L）。4 h后終止培養(yǎng)，吸棄所有液體，再加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）200 μl充分溶解，靜置于 37℃條件下30 min。用酶標儀測定570 nm光密度（OD）值，計算細胞存活率 （即每組OD值/正常對照組OD值×100%＝該組的細胞存活率）。

1.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）

將傳代后細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，處理同方法“1.2”所述。培養(yǎng)24 h后收集細胞，應用胞漿蛋白抽提試劑盒提取蛋白，測蛋白后分裝，保存于-80℃冰箱中備用。將等量蛋白以10%聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，半干轉(zhuǎn)法至NC膜上，隨后經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，室溫下1 h，加入稀釋的一抗Bcl-2（1∶300）和 Bad（1∶300），4℃條件下過夜。第 2 日晨復溫 30 min，常規(guī)方法洗膜，NBT/BCIP顯色，雙蒸水洗膜終止反應。應用圖像處理儀（Gene Company）掃描結(jié)果，Image J軟件進行半定量分析。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

細胞傳代后接種于6孔板，處理方法同“1.2”所述。培養(yǎng)24 h，吸盡培養(yǎng)基，用胰蛋白酶（0.25%）消化細胞后收集，磷酸鹽緩沖液（PBS）液洗2次，每組細胞收集為1管，每管加入凋亡試劑盒中的結(jié)合緩沖液將細胞重懸，隨后將細胞轉(zhuǎn)移到試管中。每管再分別加入10 μl的PI和5 μl的Annexin VFITC。避光，室溫放置5 min，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，Sigma Plot 2000作圖。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用最小顯著差（LSD-t）法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。每組數(shù)據(jù)至少從3次獨立的實驗中獲得。

2 結(jié)果

2.1 MG132對A549細胞成活率的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，隨著MG132濃度的增加A549細胞存活率逐漸下降（表1），呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系。并且，與正常對照組比較，除了0 μmol/L組外，其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05）。

2.2 MG132對A549細胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，空白對照組 A549 細胞凋亡率約（4.0±1.4）%，0 μmol/L 組凋亡率為（4.1±1.7）%、5 μmol/L 組凋亡率為（12.2±2.1）%、10 μmol/L組凋亡率為 （26.3±2.9）%、20 μmol/L 組凋亡率為 （33.1±3.0）%、40 μmol/L 組凋亡率為（54.2±4.7）%，與空白對照組比，除0 μmol/L組外，其余各組差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.3 MG132對A549細胞中Bcl-2和Bad蛋白的影響

Western Blot結(jié)果顯示，隨著MG132的濃度增高A549細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表達逐漸降低（圖1A），除0 μmol/L組外，其余各組與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。而促凋亡蛋白Bad的表達在各組中無明顯變化（圖1B）。與空白對照組比，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

圖1 Western Blot檢測細胞內(nèi)Bcl-2和Bad蛋白的表達

3 討論

泛素-蛋白酶體通路[7]（UPP）調(diào)控著真核生物細胞內(nèi)絕大部分蛋白質(zhì)的降解過程，參與細胞轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、蛋白質(zhì)降解、細胞凋亡、應激反應和受體胞吞等多種生理過程，能夠通過多種途徑影響細胞周期的進行，是真核細胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)。MG132[8]（Z-Leu-Leu-Leu-CHO，三肽基乙醛）可以抑制UPP途徑介導的蛋白質(zhì)降解，是一種常用的肽醛類26S蛋白酶體抑制劑，如影響NF-κB、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)凋亡信號通路、調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白和凋亡調(diào)控蛋白等過程，從而抑制細胞的增殖促進細胞凋亡，是很有發(fā)展前途的抗腫瘤藥物。也有研究表明：與凋亡調(diào)控相關(guān)的Bcl-2家族、caspase和凋亡抑制因子等的降解均與UPP有關(guān)[9-10]。在本研究中筆者特別關(guān)注Bcl-2家族在UPP通路中的作用，在細胞凋亡調(diào)控機制方面，Bcl-2是迄今研究最廣泛而深入的凋亡調(diào)控基因之一，在細胞凋亡中起著非常重要的作用，Bcl-2能夠抑制細胞凋亡，而Bad則促進細胞的凋亡，是該家族中兩組作用相反的蛋白。本研究應用體外培養(yǎng)的A549人肺腺癌細胞，給予不同濃度蛋白酶體抑制劑MG132處理一段時間后，檢測細胞凋亡率的變化，同時觀察對細胞中Bcl-2和Bad兩種蛋白表達水平的影響，初步探討在A549細胞凋亡中UPP通路的作用及其可能的機制。

該研究結(jié)果顯示，隨著MG132濃度增加A549細胞的凋亡率逐漸增加，并且細胞中Bcl-2蛋白的表達水平也逐漸降低。同時在筆者的實驗中也發(fā)現(xiàn)，Bad蛋白的表達水平在各目前仍存在爭議。有學者基于Graves甲亢患者的免疫損傷，建議首選潑尼松治療，小劑量應用2～3周后再行ATD治療。Graves甲亢初期即可出現(xiàn)白細胞減少和肝功能受損，ATD治療會加重肝損害和白細胞降低，甚至導致粒細胞缺乏。多數(shù)學者認為，ATD致免疫功能紊亂是導致粒細胞缺乏的重要原因。免疫介導對肝損害起著重要的作用，從本質(zhì)上講，肝損害也是自身免疫損害的一部分[11]。鑒于上述原因，筆者認為在嚴重甲亢、肝功能損害、白細胞減少、皮膚過敏時，應在使用ATD的同時，小劑量短期加用潑尼松，并且應定期復診，密切監(jiān)測患者不良反應。

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