張燕玲，陳 超，楊 慧，薛小平

(1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，陜西 西安 710072;2.國(guó)家微檢測(cè)系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710069)

微球技術(shù)的雛形最早可追溯到20世紀(jì)70年代，Horan等采用兩種大小不同的微球在流式細(xì)胞儀上同時(shí)對(duì)兩種抗體進(jìn)行免疫分析[1]；McHugh等又用4種不同直徑的微球同時(shí)檢測(cè)血清中相應(yīng)的HIV抗體[2]。隨后研究發(fā)現(xiàn)，僅靠識(shí)別微球大小來(lái)檢測(cè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足高通量和高靈敏度檢測(cè)的需要。近年來(lái)，Luminex公司在微球合成過(guò)程中加入紅色和橙色熒光染料，通過(guò)調(diào)節(jié)兩種熒光染料的比例獲得不同顏色的微球，即給每種顏色的微球一個(gè)地址，開發(fā)出熒光可尋址微球(Fluorescent addressable microsphere)，彌補(bǔ)了以往多元檢測(cè)模式的不足[3]。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出的熒光微球技術(shù)(Fluorescent microsphere-based technology)是將聚苯乙烯羧基微球、熒光染料標(biāo)記系統(tǒng)、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)及微球?qū)Ｓ昧魇郊?xì)胞儀等有機(jī)整合在一起的一項(xiàng)新技術(shù)，通過(guò)熒光微球信號(hào)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集和分析，具有快速分析多重生物反應(yīng)的特點(diǎn)及高靈敏度和特異性，可用于抗原抗體、核酸探針檢測(cè)等領(lǐng)域的研究[4，5]。作者在此通過(guò)檢測(cè)人免疫球蛋白G(IgG)和豬血紅蛋白(Hb)與熒光微球的偶聯(lián)效率，提示熒光微球技術(shù)可應(yīng)用于免疫檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料和儀器

111#和172#聚苯乙烯熒光微球、熒光親和素SA-PE，Luminex公司；人免疫球蛋白G(IgG)、生物素化羊抗人IgG(Biotin-羊抗人IgG)、豬血紅蛋白(Hb)、兔抗豬血紅蛋白多克隆抗體(Hb-PcAb)，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Biotin-NHS，CALBIOCHEM公司；碳二亞胺(EDC)，PIERCE公司。

Luminex-100TM熒光微球檢測(cè)系統(tǒng)，Luminex公司；Millipore MultiScreen Assay System，Millipore公司；8543型紫外可見分光光度計(jì)，Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 生物素標(biāo)記Hb-PcAb

將Biotin-NHS溶解于DMSO，加入抗體Hb-PcAb，按VBiotin-NHS∶V抗體=1∶8比例混合避光反應(yīng)，用PBS透析后加入等體積甘油，-20 ℃保存[6]。

1.2.2 紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)IgG和Hb與熒光微球偶聯(lián)效率

超聲波水浴振散微球后向每管分別加入20 μL 172#和111#微球(172#微球與IgG偶聯(lián)，111#微球與Hb偶聯(lián))，迅速配制50 mg·mL-1的EDC溶液加入微球中，混勻，于室溫避光溫育20 min，PBS清洗微球2次[7]；加入濃度(μg·mL-1)為25、50、100、150、200、250的IgG或Hb溶液各500 μL，紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)不同濃度IgG和Hb溶液吸光值，記為OD0；空白對(duì)照管加入500 μL PBS，混勻，于室溫避光振動(dòng)溫育2 h后，離心，測(cè)上清液吸光值，記為OD1；再用PBS清洗微球2次，離心后測(cè)上清液吸光值，分別記為OD2和OD3；最后重懸微球，于4 ℃下避光保存。偶聯(lián)效率由下式計(jì)算：

1.2.3 Luminex-100TM檢測(cè)IgG和Hb與熒光微球偶聯(lián)效率

將Biotin-羊抗人IgG和生物素標(biāo)記Hb-PcAb分別按1∶1000、1∶5000、1∶10 000、1∶100 000稀釋，與172#、111#微球各2 μL(約6000個(gè))混合后加入96孔不透光板中，室溫避光溫育30 min，PBS清洗微球2次，然后加入熒光親和素SA-PE(1∶10稀釋)于室溫避光溫育30 min，用Luminex-100TM檢測(cè)偶聯(lián)效率，結(jié)果由平均熒光強(qiáng)度(Mean fluorescent intensity，MFI)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白偶聯(lián)效率結(jié)果(表1)

表1 紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)IgG、Hb與熒光微球偶聯(lián)效率結(jié)果

由表1可看出，IgG和Hb與熒光微球偶聯(lián)效率隨蛋白濃度增大而提高，在100 μg·mL-1時(shí)達(dá)最大，隨后呈下降趨勢(shì)。

2.2 Luminex-100TM檢測(cè)蛋白偶聯(lián)效率結(jié)果(圖1、圖2)

圖1 Luminex-100TM檢測(cè)IgG與172# 熒光微球偶聯(lián)效率結(jié)果

圖2 Luminex-100TM檢測(cè)Hb與111# 熒光微球偶聯(lián)效率結(jié)果

由圖1和圖2可以看出，IgG和Hb在6種濃度梯度下偶聯(lián)所得熒光值均較高，說(shuō)明熒光微球檢測(cè)技術(shù)非常靈敏，偶聯(lián)效率都較為理想；空白1(Blank1)為未偶聯(lián)任何蛋白的空球；空白2(Blank2)為偶聯(lián)Hb和IgG的微球(未加生物素化檢測(cè)抗體)，提示這6種濃度梯度對(duì)偶聯(lián)效率影響均不大。在保證偶聯(lián)效率較高且不浪費(fèi)抗原或抗體的前提下，宜選擇100 μg·mL-1作為偶聯(lián)蛋白的濃度。

2.3 討論

目前免疫學(xué)檢測(cè)方法有酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù)(EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)和熒光偏振免疫測(cè)定(FPIA)等技術(shù)[8，9]。熒光微球技術(shù)是近年來(lái)產(chǎn)生和發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，與傳統(tǒng)流式細(xì)胞技術(shù)和ELISA等檢測(cè)技術(shù)相比，在檢測(cè)靈敏度、效率、應(yīng)用范圍等方面具有顯著的優(yōu)越性，隨著微球技術(shù)和生物芯片技術(shù)的不斷成熟和發(fā)展，將有可能廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)。本研究以人免疫球蛋白G和豬血紅蛋白作為抗體和抗原代表與熒光微球偶聯(lián)，從檢測(cè)結(jié)果可以看出熒光微球非常易于與蛋白偶聯(lián)且穩(wěn)定性較好，提示該技術(shù)如應(yīng)用于微生物、細(xì)胞因子、興奮劑篩查等各種高通量快速免疫檢測(cè)反應(yīng)[10～12]，將具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

以聚苯乙烯羧基熒光微球?yàn)楣滔噍d體，將人免疫球蛋白G(IgG)和豬血紅蛋白(Hb)分別與微球偶聯(lián)，應(yīng)用Luminex-100TM熒光微球檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)抗體IgG和抗原Hb與熒光微球的偶聯(lián)效率。結(jié)果表明，采用100 μg·mL-1抗體或抗原濃度可以獲得較高的偶聯(lián)效率，且檢測(cè)快速靈敏。應(yīng)用熒光微球進(jìn)行抗原抗體免疫檢測(cè)可行。

致謝：本研究由國(guó)家微檢測(cè)系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心資助完成。

參考文獻(xiàn)：

[1] Wood W I，Gitschier J，Lasky L A，et al.Base composition-independent hybridization in tetramethylammonium chloride：A method for oligonucleotide screening of highly complex gene libraries[J].Proc Natl Acad Sci USA，1985，82(6)：1585-1588.

[2] Iannone M A，Taylor J D，Chen J，et al.Multiplexed single nucleotide polymorphism genotyping by oligonucleotide ligation and flow cytometry[J].Cytometry，2000，39(2)：131-140.

[3] Seideman J，Peritt D.A novel monoclonal antibody screening me-thod using the Luminex-100 microsphere system[J].J Immunol Methods，2002，267(2)：165-171.

[4] Vercammen M，Meirlaen P，Sennesael J，et al.Diagnostic accuracy of the FIDIS multiplex fluorescent microsphere immunodetection system for anti-extractable nuclear antigen(ENA) antibodies in connective tissue diseases[J].Clin Chem Lab Med，2007，45(4)：505-512.

[5] Etienne K A，Kano R，Balajee S A.Development and validation of a microsphere-based Luminex assay for rapid identification of clinically relevant aspergilli[J].J Clin Microbiol，2009，47(4)：1096-1100.

[6] Schliemann C，Roesli C，Kamada H，et al.Invivobiotinylation of the vasculature in B-cell lymphoma identifies BST-2 as a target for antibody-based therapy[J].Blood，2010，115(3):736-744.

[7] Fulton R J，McDade R L，Smith P L，et al.Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system[J].Clin Chem，1997，43(9):1749-1756.

[8] Campos C B，Paim B A，Cosso R G，et al.Method for monitoring of mitochondrial cytochrome C release during cell death：Immunodetection of cytochrome C by flow cytometry after selective permeabilization of the plasma membrane[J].Cytometry A，2006，69(6)：515-523.

[9] Brockman A，Singlam S，Phiaphun L，et al.Field evaluation of a novel colorimetric method——Double-site enzyme-linked lactate dehydrogenase immunodetection assay-to determine drug susceptibilities ofPlasmodiumfalciparumclinical isolates from northwestern Thailand[J].Antimicrob Agents Chemother，2004，48(4)：1426-1429.

[10] Zhong L，Zhang W，Zer C，et al.Protein microarray：Sensitive and effective immunodetection for drug residues[J].BMC Biotechnol，2010，10(1)：12.

[11] 王勤，吳雄飛，王軍霞，等.構(gòu)建腫瘤壞死因子-α免疫微球的實(shí)驗(yàn)研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2005，22(6)：1219-1222.

[12] 翟榮玲，徐懷英，王友令，等.新城疫殼聚糖微球疫苗免疫效果的研究[J].微生物學(xué)報(bào)，2007，47(4)：692-696.