宋冬梅 ，黎鄂恒，吳 寧，李堂秀 ，顧承剛

(1.湖北省荊門市第一人民醫(yī)院藥劑科，湖北 荊門 448000; 2.湖北省中醫(yī)院藥事部，湖北 武漢 430061;3.武漢藥谷科技開發(fā)有限公司，湖北 武漢 430070)

心腦聯(lián)通片由燈盞細辛、虎杖、野山楂、柿葉、刺五加、葛根、丹參組方，由心腦聯(lián)通膠囊[1]改變制劑成型工藝而成，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，用于瘀血閉阻引起的胸痹、眩暈，癥見胸悶、胸痛、心悸、頭暈、頭痛、耳鳴等，以及冠心病心絞痛、腦動脈硬化、高脂血癥見上述證候者。筆者保持原膠囊劑型的提取工藝，僅改變成型工藝，將其制成心腦聯(lián)通片，并研究了其質(zhì)量標(biāo)準，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

P3000型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，包括3000 UV紫外檢測器;CQ250型超聲波儀(上海超聲波儀器廠)。硅膠G(青島海洋化工廠);羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。心腦聯(lián)通片(武漢藥谷科技開發(fā)有限公司制劑室提供，批號為20080301，20080302，20080303，20080304，20080305，20080306);大黃素對照品(批號為110756－200110)、野黃芩苷對照品(批號為110842－200403)、葛根素對照品(批號為 110752－200310)，丹參酮ⅡA對照品(批號為110766－200403)，均由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用;甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 燈盞細辛

取本品10片，除去包衣，研細，稱取 2 g，加熱水25 mL，研磨5 mim，離心，取上清液，用乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，棄去乙酸乙酯液，水層用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2～3，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，水層備用，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含燈盞細辛的自制陰性樣品10片，同供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對照品溶液。取野黃芩苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。照薄層色譜法，吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以冰醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(見圖1 A)。

2.1.2 葛根[2]

取2.1.1項下水液，水浴蒸干，殘渣加甲醇適量使溶解，加中性氧化鋁7 g，拌勻，揮干，加入50%甲醇50 mL振搖提取，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣加乙醇1 mL溶解，過濾，作為供試品溶液。取不含葛根的自制樣品10片，同供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對照品溶液。取葛根素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。照薄層色譜法，吸取對照品溶液5 μL、供試品溶液和陰性對照品溶液各10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿－甲醇－水(7∶2.5∶0.25)為展開劑，展開，取出，晾干，置飽和氨蒸氣中放置10 mim，取出，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(見圖1 B)。

2.1.3 丹參

取本品10片，除去包衣，研細，稱取3 g，加甲醇30 mL超聲處理30 mim，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL，加熱使溶解，放冷，用乙醚提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，低溫揮干，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含丹參的自制陰性樣品10片，同供試品溶液的制備方法制備，即得陰性對照品溶液。取丹參酮ⅡA對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。照薄層色譜法，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(12∶1)為展開劑，展開2次，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(見圖1 C)。

2.2 大黃素含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Hypersil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5μm);流動相:甲醇－0.1%磷酸(80∶20);檢測波長:254 nm;柱溫:25℃;流速:1 mL/min;進樣量 10 μL;檢測靈敏度:1.0000 AUFS。理論板數(shù)按大黃素峰計算應(yīng)不低于4000。色譜圖見圖2。

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的大黃素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得對照品溶液。取本品5片，除去包衣，研細，稱取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷25 mL和2.5 mol/L的硫酸溶液20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，置80℃水浴中加熱回流2 h，冷卻至室溫，密塞，再稱定質(zhì)量，用三氯甲烷補足減失的質(zhì)量，搖勻，分取三氯甲烷液，精密量取10 mL，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液，取不含虎杖的自制陰性樣品，同供試品溶液制備方法，制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密稱取大黃素對照品0.0093 g，置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取3 mL，置50，25，10，5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為5.58，11.16，27.9，55.8 μg/mL 的對照品溶液，分別吸取各對照品溶液10 μL，注入色譜儀測定，以大黃素的進樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，得回歸方程 Y=4016662 X+37897，r=0.9999(n=5)。結(jié)果表明，大黃素進樣量在 0.0558 ～ 0.9300 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液，按擬訂的色譜條件，重復(fù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果的 RSD=0.69%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:分別精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h時進樣，測定峰面積。結(jié)果的 RSD為 0.42%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)保持穩(wěn)定，能保證測定的時間要求。

重復(fù)性試驗:取同一批樣品6份，按供試品溶液制備方法平行處理并測定，計算含量。結(jié)果含量平均值為2.864 mg/g，RSD=1.22%(n=6)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品(批號為20080301，含量為2.864 mg/g)6份，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.4 g/L的大黃素對照品溶液1 mL，依法測定含量，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 大黃素加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.2.4 樣品含量測定

取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，注入色譜儀，記錄峰面積，按外標(biāo)法計算大黃素的含量，每批樣品測定3份。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(mg/片)

3 討論

關(guān)于葛根的薄層色譜鑒別，原質(zhì)量標(biāo)準中樣品處理方法復(fù)雜、損失較大。通過試驗發(fā)現(xiàn)，葛根素水溶性極強，用乙酸乙酯萃取后仍保留在水層，故將提取野黃芩苷后的水層用氧化鋁吸附除雜，50%甲醇振搖提取，即可用將葛根素較好地分離出來。原質(zhì)量標(biāo)準中使用五元展開劑，配制麻煩，故參照2005年版《中國藥典(一部)》葛根藥材鑒別項下的展開劑，以三氯甲烷－甲醇－水(7∶2.5∶0.25)為展開劑，效果良好。改進后的鑒別方法操作更簡便、靈敏度更高，提高了可操作性和檢驗的準確性。

關(guān)于丹參的薄層色譜鑒別，原質(zhì)量標(biāo)準中使用石油醚(60～90℃)作為萃取溶劑，通過試驗發(fā)現(xiàn)，雖然提取的雜質(zhì)較少，但丹參酮ⅡA提取效率低，需要較大的點樣量方可檢出。改用乙醚萃取后，萃取效率提高，正常點樣即可檢出，且雜質(zhì)對其無干擾。原質(zhì)量標(biāo)準中展開劑為甲苯－乙酸乙酯(18∶1)，由于甲苯毒性較大，改用石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(12∶1)，展開2次，展開效果良好。改進后的鑒別方法提高了檢測的靈敏度，減少了毒性試劑對環(huán)境的污染，更加科學(xué)環(huán)保。

關(guān)于虎杖所含大黃素的含量測定，原質(zhì)量標(biāo)準中分取氯仿層時較易損失，操作引起的誤差較大。將其改為分取氯仿層后精密量取部分氯仿層，通過體積換算得出原液的含量，減小了操作誤差;并將流動相由甲醇－0.2%磷酸(75∶25)調(diào)整為甲醇－0.1%磷酸(80∶20)，增大了甲醇比例，縮短了保留時間，柱溫25℃即可獲得較好的分離效果，同時降低了酸濃度，減小了流動相對色譜系統(tǒng)的損害，且柱效較高，故選用甲醇－0.1%磷酸(80∶20)作為流動相。改進后的含量測定方法更加簡便、高效。

文中建立的定性定量方法簡便、快速、重現(xiàn)性好，能有效地控制心腦聯(lián)通片的質(zhì)量。

[1]WS－10031－(ZD－0031)－2002，中華人民共和國國家藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準·地標(biāo)升國標(biāo)(心系分冊)[S].

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:233，52.