溫靜靜， 謝汝佳， 韓 冰， 楊 婷， 錢 程， 楊 勤

(貴陽醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，貴州 貴陽 550004)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指某種原因?qū)е录毎麅?nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)失衡或蛋白質(zhì)加工運輸障礙、生理功能紊亂的一種亞細胞器病理過程。近些年發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與機體的多種疾病密切相關(guān)，如心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及肝損傷［1］。關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝損傷的關(guān)系已有一些研究報道，但關(guān)慢性肝損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)系的研究甚少，特別是關(guān)于肝纖維化發(fā)生中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究鮮有報道，僅有的研究大多針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子生物學(xué)改變上，而對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學(xué)觀察較少。因此，本研究擬以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為切入點，從亞細胞水平探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)及功能改變在慢性肝細胞損傷、肝纖維化發(fā)生機制中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 試劑 四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)(分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠，天津);GRP78(glucose－regulated protein 78)多克隆抗體、DAB顯色試劑盒和SABC試劑盒(武漢博士德公司);總RNA提取試劑盒(Fermentas);GRP78引物由大連寶生物科技公司設(shè)計合成。

1.2 動物分組 健康雄性Wistar大鼠32只，體重(180±20)g(貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為:正常對照組、肝纖維化組，每組各16只。

1.3 動物模型建立 新鮮配制60%CCl4植物油溶液，按3 L/kg的劑量皮下注射，每隔3 d注射1次造模。分別在實驗第4周末和第8周末股動脈放血處死正常對照組與肝纖維化組大鼠，處死前稱體重，留取血液及全部肝臟。

2 方法

2.1 計算肝臟指數(shù) 計算方法為(肝臟重量/體重)×100﹪。

2.2 測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)采用Siemens Advia 1650全自動生化分析儀測定。

2.3 肝組織病理切片 常規(guī)石蠟包埋切片，行HE及VG染色，光鏡下觀察肝臟病理變化，并參照肝纖維化分級法［2］進行膠原纖維增生程度半定量分析。

2.4 肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察 采用3%戊二醛前固定，1%四氧化鋨后固定;脫水;包埋;聚合;切片，切片厚度為50 μm;染色采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染法;HITACHI H－7650透射電子顯微鏡進行觀察、拍照。

2.5 GRP78免疫組化檢查 采用SABC法按試劑盒說明操作。陰性對照以PBS液代替Ⅰ抗。結(jié)果判定:光鏡下觀察胞漿染成棕黃色的細胞為陽性。400倍下觀察不少于5個高倍視野，記數(shù)陽性細胞個數(shù)并計算其陽性細胞所占百分比(﹪)。

2.6 GRP78 mRNA real－time PCR檢測 采用雙股DNA結(jié)合熒光系統(tǒng)(SYBR Green)，按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒操作程序進行。反應(yīng)總體積為25 μL，反應(yīng)條件:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)，保存其循環(huán)閾值(Ct)。以每例標本組織的目的片段與帶內(nèi)參照片段的Ct比值作為該標本基因表達的相對數(shù)值。β－actin上游引物5'－TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT－3'，下游引物 5' －GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA－3'，擴增條帶700 bp。GRP78上游引物5'－TGGAATCTTCACCTCAGAGTG－3'，下游引物 5'－ATATCCAAGGTGAACACACAC －3'，擴增條帶164 bp。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，病理學(xué)半定量結(jié)果采用秩和檢驗。

結(jié) 果

1 各組大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性的比較

由表1可見，肝纖維化4周組、8周組大鼠肝臟指數(shù)均顯著高于正常組大鼠(P＜0.01);血清AST和ALT活性均較正常組大鼠顯著增加(P＜0.01)。

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性Table 1.The liver index and serum activity of ALT and AST in each group of rats(.n=8)

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)、血清ALT和AST活性Table 1.The liver index and serum activity of ALT and AST in each group of rats(.n=8)

△△P ＜0.01 vs normal groups;＊＊P ＜0.01 vs 4－week liver fibrosis group.

4－week normal 2.88±0.21 45.00±9.14 110.00±25.608－week normal 3.10 ±0.16 52.00 ±11.26 121.00±19.034－week liver fibrosis 4.21±0.70△△ 727.00±249.70△△ 616.00±209.98△△8－week liver fibrosis 5.43±0.90＊＊ 1260.00±579.25＊＊ 1167.00±318.18＊＊

2 肝臟病理變化

HE染色鏡下可見正常組大鼠肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，無膠原纖維增生;肝纖維化4周組大鼠肝細胞輕度脂肪樣變，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織輕度增生;肝纖維化8周組大鼠肝細胞脂肪樣變嚴重，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織大量增生，內(nèi)有較多炎癥細胞浸潤，膠原纖維形成纖維間隔，可見假小葉形成，見圖1。

Figure 1.HE staining of rat hepatic tissues in each group(×400).A:normal group;B:4－week liver fibrosis group;C:8－week liver fibrosis group.圖1 各組大鼠肝組織HE染色結(jié)果

3 各組大鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學(xué)變化

圖2可見，正常組大鼠肝細胞胞膜完整，胞質(zhì)均勻，細胞核圓且居中，核仁明顯，脂滴少見。細胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，排列整齊，排列的方向與細胞長軸平行。肝纖維化4周組大鼠肝細胞腫脹，脂滴增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，出現(xiàn)不規(guī)則擴張、斷裂、扭曲。肝纖維化8周組大鼠肝細胞縮小，脂滴明顯增多，細胞核皺縮形狀不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，核仁消失，核周間隙增寬，間質(zhì)增生，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目明顯減少，明顯擴張。

Figure 2.The morphological changes of endoplasmic reticulum in rats of each group(×2000).The arrows showed endoplasmic reticulum structure.A:normal group;B:4－week liver fibrosis group;C:8－week liver fibrosis group.圖2 各組大鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu)

4 各組大鼠肝臟GRP78蛋白表達

由表2和圖3可見，棕黃色陽性表達的GRP78蛋白在正常組大鼠肝細胞中很少見;在肝纖維化4周組大鼠肝細胞中可見較多表達，與正常組比較有明顯差異;在肝纖維化維化8周組大鼠可見GRP78蛋白廣泛在小葉內(nèi)肝細胞胞漿中呈強陽性表達，且顯著多于正常組及肝纖維化4周組，差異顯著(P＜0.01)。肝纖維化4周組大鼠肝臟GRP78 mRNA表達較正常組明顯增加(P＜0.01);肝纖維化8周組大鼠肝臟GRP78 mRNA表達較正常組及肝纖4周組均顯著增加，差異顯著(P＜0.01)。

表2 各組大鼠肝臟GRP78蛋白及mRNA表達比較Table 2.The expression of GRP78 protein and mRNA in livers of each group(.n=8)

表2 各組大鼠肝臟GRP78蛋白及mRNA表達比較Table 2.The expression of GRP78 protein and mRNA in livers of each group(.n=8)

△△P＜0.01 vs normal groups;＊＊P＜0.01 vs 4－week liver fibrosis group.

4 － week normal 0.25 ±0.08 148.81 ±29.238 － week normal 0.29 ±0.04 163.32 ±17.774 － week liver fibrosis 34.60 ±11.67△△ 464.99 ±253.18△△8 － week liver fibrosis 55.54 ±8.77＊＊ 556.54 ±483.75＊＊

Figure 3.Expression of GRP78 in rat liver tissues(×400).A:normal group;B:4－week liver fibrosis group;C:8－week liver fibrosis group.圖3 免疫組化顯示肝組織中GRP78的表達

討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)的主要生理功能是負責正確折疊蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運、信號肽識別和糖基化修飾、Ca2+的貯存和調(diào)節(jié)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。然而，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取、釋放Ca2+紊亂或者蛋白質(zhì)的加工運輸障礙時，就會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。研究證實，ERS是一種信號反應(yīng)通路系統(tǒng)，屬細胞自我保護機制的一部分［3］。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，GRP78作為分子伴侶，介導(dǎo)新生蛋白的加工成熟，是促進正常生長狀態(tài)下細胞蛋白質(zhì)成熟、維系細胞機能和生命的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)蛋白，被認為是ERS標志性蛋白［4，5］。有研究表明在熱休克、低糖、低氧、過氧化物增多等多種應(yīng)激狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)新生蛋白發(fā)生錯誤折疊，激活細胞內(nèi)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，通過活化轉(zhuǎn)錄因子6(activation transfer factor－6，ATF－6)作用于GRP78啟動子，上調(diào)GRP78基因的轉(zhuǎn)錄活性，使其表達量增高［6，7］。

肝細胞擁有高度發(fā)達的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與肝細胞的許多重要功能，諸如蛋白質(zhì)合成、糖化和分泌，脂類物質(zhì)的代謝、糖代謝、毒物及藥物代謝等。當肝組織發(fā)生損傷，蛋白質(zhì)不能在肝細胞內(nèi)進行正常折疊，那么就可能引發(fā)ERS。近些年，關(guān)于ERS與各種原因引起的肝損傷的關(guān)系已逐漸被關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)酒精性脂肪肝肝細胞有ERS發(fā)生，認為ERS發(fā)生時膜表面合成的膽固醇減少，因此通過激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白通路反應(yīng)途徑進入胞核，與靶基因結(jié)合，增強靶基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用［8，9］。還有研究顯示，酒精性肝損傷大鼠轉(zhuǎn)氨酶升高，肝組織出現(xiàn)明顯的病理損傷的同時肝臟GRP78 mRNA表達量較正常組顯著增加［10］。病毒性肝炎所引起的肝損傷與ERS也有密切關(guān)系［11］。皮下注射CCl4引起的大鼠急性肝損傷時，CCl4給藥3 h后，大鼠肝組織GRP78 mRNA的表達量比正常組顯著增加;在CCl4給藥6h后肝組織SOD活性降低，MDA含量升高;且隨著時間延長，SOD活性下降和MDA濃度升高趨勢更為明顯，提示CCl4引起的急性肝損傷中，ERS可能與氧化應(yīng)激有關(guān)系［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，CCl4引起大鼠肝臟的慢性損傷后，大鼠血清ALT、AST水平明顯增加，肝臟病理組織學(xué)HE、VG染色結(jié)果均顯示有明顯脂肪肝和肝纖維化形成。進一步利用透射電鏡成功觀察到肝細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示肝細胞超微結(jié)構(gòu)在肝纖維化4周、8周組大鼠與正常組大鼠明顯不同:肝纖維化組大鼠肝細胞內(nèi)脂滴明顯增多，細胞核形狀不規(guī)則，核周間隙增寬，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少且排列不整齊，出現(xiàn)不規(guī)則擴張、斷裂、扭曲，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學(xué)發(fā)生了明顯損傷性變化，同時免疫組化和real－time PCR研究顯示肝纖維化4周、8周組大鼠肝組織中ERS標志性蛋白GRP78蛋白及mRNA的表達量也較正常組顯著增加，且隨時間延長明顯增加，提示ERS參與了慢性肝損傷、肝纖維化的形成。有關(guān)ERS與CCl4引起肝纖維化發(fā)生機制中的作用目前不十分清楚，本課題組前期的研究已發(fā)現(xiàn)CCl4可引發(fā)大鼠肝細胞產(chǎn)生大量自由基并引起脂質(zhì)過氧化及肝細胞SOD含量下降，因而造成對自由基的清除能力下降［13］;同時本課題組的研究也發(fā)現(xiàn)在肝纖維化形成過程中肝細胞鈣激活中性蛋白酶(calcium－activated neutral protease，calpain)表達發(fā)生變化(待發(fā)表)，結(jié)合 Fei等［14］的研究，我們推測，當CCl4進入肝細胞，在肝細胞內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生大量氧自由基，引起肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+大量釋放進入胞漿，造成細胞內(nèi)Ca2+超載，由此導(dǎo)致肝細胞大量破壞;另外，當細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，可能通過激活鈣蛋白酶表達增高，過多表達的calpain通過促進NF－κB的表達誘導(dǎo)肝細胞凋亡增加，這可能是CCl4引起肝細胞損傷，導(dǎo)致纖維化發(fā)生一個可能的機制。但有關(guān)機制尚待深入研究。

［1］Dally S，Monceau V，Corvazier E，et al.Compartmentalized expression of three novel sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase 3 isoforms including the switch to ER stress，SERCA3f，in non － failing and failing human heart［J］.Cell Calcium，2009，45(2):144 －154.

［2］程明亮，楊長青.肝纖維化的基礎(chǔ)研究及臨床［M］.第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002.269－270.

［3］Tardif KD，Waris G，Siddiqui A.Hepatitis C virus，ER stress and oxidative stress［J］.Trends Microbiol，2005，13(4):159－163.

［4］Mu YP，Ogawa T，Kawada N.Reversibility of fibrosis，inflammation，and endoplasmic reticulum stress in the liver of rats fed a methionine － choline － deficient diet［J］.Lab Invest，2010，90(2):245 －256.

［5］冀菁荃，張慧英，賈建桃，等.糖調(diào)節(jié)蛋白78在大鼠腸源性內(nèi)毒素血癥促進肝硬化形成中的作用［J］.中國病理生理雜志，2010，26(12):2447 －2452.

［6］Neve EP，Ingelman － Sundberg M.Cytochrome P450 proteins:retention and distribution from the endoplasmic reticulum［J］.Curr Opin Drug Discov Devel，2010，13(1):78－85.

［7］Friedman SL，Bansal MB.Reversal of hepatic fibrosis－Fact or fantasy?［J］.Hepatology，2006，43(S1):S82 － S88.

［8］Wei Y，Wang D，Gentile CL，et al.Reduced endoplasmic reticulum luminal calcium links saturated fatty acid－mediated endoplasmic reticulum stress and cell death in liver cells［J］.Mol Cell Biochem，2009，331(1 －2):31 －40.

［9］Hegde K，Joshi AB.Hepatoprotective effect of Carissa carandas Linn root extract against CCl4and paracetamol induced hepatic oxidative stress［J］.Indian J Exp Biol，2009，47(8):660 －667.

［10］Tamaki N，Hatano E，Taura K，et al.CHOP deficiency attenuates cholestasis induced liver fibrosis by reduction of hepatocyte injury［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver physiol，2008，294(2):G498 － G505.

［11］鐘衛(wèi)衛(wèi)，林世德.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肝損傷研究進展［J］.世界華人消化雜志，2010，18(10):1021 －1025.

［12］溫 韜，張海燕，盧 靜，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在四氯化碳致大鼠急性肝損傷中的作用探討［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2008，10(10):786 －789.

［13］伍徐嫻，楊 勤，羅新華，等.丹芍化纖膠囊對肝細胞線粒體脂質(zhì)過氧化的影響［J］.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，29(5):405 －406，409.

［14］Wang Q，Zhang H，Zhao B，et al.H.IL －1β caused pancreatic β－cells apoptosis is mediated in part by endoplasmic reticulum stress via the induction of endoplasmic reticulum Ca2+release through the c－Jun N－terminal kinase pathway［J］.Mol Cell Biochem，2009，324(1 －2):183 －190.