辛 林，曹家慶，朱培謙，沈 威，毛盛勛

(南昌大學第二附屬醫(yī)院胃腸外科，江西 南昌 330006)

胃癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，細胞癌基因、凋亡抑制基因、凋亡基因等的異常表達是胃癌產(chǎn)生的重要原因。因此，特異性阻止胃癌細胞內(nèi)異常高表達基因已成為胃癌治療的新方法［1］。近年來研究表明，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是參與體內(nèi)細胞分化、增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡以及血管生成調(diào)節(jié)的重要信號分子［2］。細胞內(nèi)ROS主要是由NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)調(diào)控生成，有學者報道Nox1在人正常胃上皮組織中不表達，但在胃癌組織中高表達［3］。因此，Nox1基因有可能成為胃癌生物治療的分子靶點。

RNA干擾(RNA interfering，RNAi)是近年來發(fā)展起來的一種基因沉寂技術，已成為分子生物學研究中最為活躍的熱點之一。RNAi技術可高效、特異地下調(diào)靶基因的表達，是一種簡便而快速的基因功能研究手段［4，5］。本實驗使用RNA干擾技術抑制胃癌細胞Nox1基因的表達，研究Nox1基因與胃癌細胞凋亡的關系，期望為胃癌的基因治療提供一定的實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

人胃癌細胞株SGC－7901由上海消化外科研究所提供。siRNA序列由上海吉瑪制藥有限公司合成。Nox1 siRNA正義鏈序列為5'－CCU GAG GGG CAC CUG CUC A dTdT－3'，反義鏈序列為5'－UGA GCA GGU GCC CCU CAGG dTdT－3'。陰性對照siRNA正義鏈序列為5'－UUC UCC GAA CGU GUC ACG U dTdT－3'，反義鏈序列為5'－ACG UGA CAC GUU CGG AGA A dTdT－3'。RNA抽提試劑盒購自Invitrogen，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega。實時定量PCR所用的熒光標記物SYBR Green I混合物購自Applied Biosystems，所用引物采用Primer Express軟件(Applied Biosystem)設計，鼠抗人Nox1單克隆抗體和Annexin V－異硫氰酸熒光素(FITC)凋亡檢測試劑盒購自 BD Transduction Laboratories，辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠II抗購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 在37℃、5%CO2(V/V)飽和濕度條件下，含10% 胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)人胃癌SGC－7901細胞。轉(zhuǎn)染前1 d，換取新鮮培養(yǎng)液后調(diào)整細胞濃度為5×107/L，以每孔2 mL接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，待細胞增殖至50%～70%時，根據(jù)實驗要求換為新鮮配制的含不同siRNA的RPMI－1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1～5 d后檢測各指標。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine2000(Life Technology)，按說明書操作，簡述如下:每500μL終體積中加入siRNA 母液1.5μL(干擾濃度為60 nmol/L)與50 μL RPMI－1640 培養(yǎng)液混合，Lipofectamine 20001.2 μL與 RMPI－1640培養(yǎng)液50 μL混合，室溫放置5 min(Lipofectamine 2000與siRNA比例為1∶3)，將上述用RPMI－1640稀釋的siRNA和Lipofectamine 2000混合，室溫放置20 min。將此混合物加入細胞培養(yǎng)板(預先加入 RPMI－1640培養(yǎng)液400 μL)，混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h后換用新鮮含10%新生牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。實驗分為4組:空白對照組(正常培養(yǎng)細胞)、陰性對照組(加陰性對照siRNA)、試劑對照組(不加siRNA，僅加入轉(zhuǎn)染試劑)和干擾組(加入Nox1特異性的siRNA)。

2.3 實時定量PCR檢測胃癌SGC－7901細胞Nox1 mRNA表達 用Trizol提取細胞中總RNA，將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Nox1實時定量PCR引物進行熒光定量PCR檢測。Nox1上游引物:5'－CTC TCT CCT GGA ATG GCA TC－3'，下游引物 5'－TGG AAA ACA TCC TCA CTG GC－3'。采用GAPDH作為內(nèi)參照，上游引物:5'－GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG －3'，下游引物 5'－ GTAGCC CAG GAT GCC CTT GA－3'。采用實時定量PCR儀(MJ Research)擴增上述基因，PCR 反應體系為:cDNA 1.0 μL，2 × SYBR Green I混合物 10 μL，上、下游引物各 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL，每一樣品均重復2個反應。按下述條件進行反應:50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，58℃ 1 min，40個循環(huán)。采用GAPDH內(nèi)參照，Nox1 mRNA和GAPDH mRNA根據(jù)標準曲線得出mRNA的分子拷貝數(shù)。用GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，即目的基因mRNA含量=目的基因Ct值/內(nèi)參照GAPDH Ct值，以此比值做統(tǒng)計處理。根據(jù)FQ－PCR原理，被激發(fā)的熒光信號達到一定閾值后被熒光探頭采集，最后將其轉(zhuǎn)換成Ct值，該數(shù)值與擴增片段的實際拷貝數(shù)呈反比，即Ct值越低，實際拷貝數(shù)含量越高。

2.4 Western blotting檢測胃癌SGC－7901細胞Nox1蛋白表達 取轉(zhuǎn)染72 h后的胃癌SGC－7901細胞總蛋白50μg做SDS－PAGE電泳。電泳結束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入 Nox1鼠抗人多克隆抗體(1∶500)及GAPDH鼠抗人多克隆抗體(1∶500)室溫孵育3 h，TBST洗膜，加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠多克?、蚩?1∶2000)1 h，TBST洗膜，用DAB顯色。經(jīng)自動電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描并測定雜交條帶IA，實驗重復3次，將Nox1 IA/GAPDH IA平均值作為其蛋白表達水平的相對值。

2.5 CCK8細胞增殖實驗 胃癌SGC－7901細胞培養(yǎng)于96孔板，2×103cells/well，實驗分為4組:空白對照組(正常培養(yǎng)細胞)，陰性對照組(加陰性對照siRNA)，試劑對照組(不加siRNA，僅加入轉(zhuǎn)染試劑)和干擾組(加入Nox1特異性的siRNA)，每種處理方式接種5復孔，24 h后細胞處于指數(shù)生長階段轉(zhuǎn)染 Nox1 siRNA，分別在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h、120 h 加入 CCK810 μL，37 ℃ 培育4 h，酶標儀(Bio－TEK ，型號Quant)檢測其450 nm的吸光度(A)，取5個時點的A值平均值并繪制生長曲線。

2.6 細胞凋亡檢測 細胞制成1×108/L的懸液，取100 μL細胞懸液放入試管中，加入 FITC－Annexin V 10 μL和 PI 5 μL染色，室溫下避光靜置15 min后加400 μL孵育緩沖液，1 h內(nèi)流式細胞儀檢測。先通過散射光信號分選細胞與細胞碎片，然后再在雙變量熒光信號散點圖上區(qū)分出活細胞、死亡細胞與凋亡細胞。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 Nox1 siRNA對胃癌細胞Nox1 mRNA和相應蛋白表達水平的影響

將Nox1 siRNA轉(zhuǎn)染至胃癌SGC－7901細胞，24、48及72 h后抽提其RNA，逆轉(zhuǎn)錄，經(jīng)熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24 h后干擾組細胞Nox1 mRNA表達量開始下降，與陰性對照組之間差異顯著(P＜0.05)，48 h時下降更為明顯，與陰性對照組之間差異顯著(P＜0.01)，見圖1。轉(zhuǎn)染72 h后抽提蛋白，經(jīng)Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，干擾組細胞Nox1蛋白表達水平較陰性對照組下降明顯，蛋白表達量是陰性對照組的17.55%，其抑制率為82.45%，與陰性對照組比較，顯著差異(P ＜0.01)，見圖2。

2 Nox1 siRNA對胃癌細胞生長的影響

Nox1 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌SGC－7901細胞72 h后干擾組胃癌細胞的增殖速度較陰性對照組、空白組及試劑對照組有顯著下降(P＜0.05)，而陰性對照組與空白組及試劑對照組間無顯著差異(P＞0.05)，見圖3。

3 流式細胞術檢測Nox1 siRNA對胃癌細胞凋亡的影響

Nox1基因沉默72 h后，經(jīng)Annexin V/PI雙染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，空白對照、陰性對照、試劑對照和干擾組的凋亡率分別為(6.45±0.58)%、(8.16±1.03)%、(9.15±0.80)%和(53.44±3.40)%。干擾組細胞凋亡率較陰性對照組、空白對照組及試劑對照組有明顯上升，差異顯著(P ＜0.01)，見圖4。

Figure 1.Real－time quantitative PCR results of Nox1 mRNA expression in SGC－7901 cells treated with Nox1 siRNA for 24，48 and 72 h..n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.05 vs negative control or reagent control group.圖1 siRNA抑制SGC－7901細胞 Nox1 mRNA表達的實時定量PCR結果

Figure 2.Nox1 protein expression in SGC －7901 cells treated by Nox1 siRNA for 72 h..n=4.＊＊P＜0.01 vs negative control or reagent control group.圖2 Nox1 siRNA抑制SGC－7901細胞Nox1蛋白的表達

Figure 3.The growth curves of SGC－7901 cell after Nox1 siRNA transfection..n=4.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative control or reagent control group.圖3 轉(zhuǎn)染Nox1 siRNA后胃癌SGC－7901細胞生長的變化

Figure 4.SGC－7901 cell apoptotic rate in different groups after Nox1 siRNA transfection for 72 h..n=4.＊＊P＜0.01 vs negative control or reagent control group.圖4 轉(zhuǎn)染Nox1 siRNA 72 h后不同處理組SGC－7901細胞凋亡率比較

討 論

Nox首先被發(fā)現(xiàn)于中性粒細胞和巨噬細胞中，在炎癥反應時這兩種細胞發(fā)生“氧化爆發(fā)”產(chǎn)生大量ROS而構成機體抵抗病原體的第一防線，與吞噬細胞中Nox所制造的ROS不同，其它細胞內(nèi)Nox產(chǎn)生的ROS并非主要起細胞防御作用，而是作為第二信使，參與細胞分化、增殖、凋亡的調(diào)節(jié)［6］。在不同種類的細胞中發(fā)現(xiàn)了一系列NADPH氧化酶的催化亞基，分別稱其為 Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、DUOX1 及DUOX2，這些同源物后來被命名為Nox蛋白家族。有學者研究了Nox家族各個成員在多個腫瘤細胞系以及腫瘤組織及癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)在不同的腫瘤組織中，Nox家族各個成員表達的程度不同，Nox活性與腫瘤細胞的侵襲力及增殖能力相關［7］。

Nox1基因位于X染色體上，其至少有3種剪切變構體(splice variants)，即 Nox1α(外顯子 1 ～13)、Nox1β(外顯子1 ～10，12，13)、Nox1γ(外顯子 1 ～5，14)。選擇性地剪接掉Nox1外顯子11，則不能編碼蛋白產(chǎn)生超氧化物。正常組織中Nox1主要在結腸中有低表達，血管平滑肌中、子宮、前列腺、破骨細胞、視網(wǎng)膜細胞也有微弱表達［8］。研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤或者轉(zhuǎn)化細胞系中都可以檢測到 Nox1的高表達［9，10］。Nox1可以通過產(chǎn)生ROS來增加腫瘤細胞抵抗凋亡的能力從而促進腫瘤細胞生長［11］。最近有學者報道Nox1活性的高低與結腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力有關［12］。因此，Nox1基因可以成為抑制腫瘤生長的分子靶點［13］。研究證明Nox1基因在人胃正常上皮黏膜細胞、慢性萎縮性胃炎、胃腺瘤及胃癌周圍組織中表達水平較低，而在胃的腸型及彌漫型腺癌，包括印戒細胞癌中有高表達，表達Nox1的胃癌組織同時具有胃型和腸型兩種表型，因此，Nox1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［14］。

本實驗設計構建了針對Nox1基因的siRNA并將其導入胃癌細胞株SGC－7901中，觀察siRNA對Nox1基因表達的影響以及Nox1過度表達被抑制后胃癌細胞生長活性的變化，明確Nox1基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及與胃癌細胞生存的關系。本實驗的結果證實，Nox1 siRNA可在mRNA及蛋白質(zhì)水平上顯著抑制Nox1基因表達，胃癌細胞轉(zhuǎn)染Nox1 siRNA后其生長受到明顯抑制并出現(xiàn)大量凋亡。研究結果初步顯示利用RNA干擾技術阻斷胃癌Nox1基因的異常高表達可以誘導胃癌細胞凋亡、抑制胃癌細胞的生長，Nox1基因是胃癌生物治療的一個新靶點。

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