文先杰， 徐世元， 雷洪伊， 梁 樺， 鄭雪琴， 楊承祥

(1 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州510282;2 佛山市第一人民醫(yī)院麻醉科，廣東 佛山528000)

局麻藥在臨床常用濃度下也可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞的腫脹、退行性變，神經(jīng)脫髓鞘、空泡癥、染色體溶解、細(xì)胞程序性死亡等。暫時(shí)性神經(jīng)病學(xué)綜合征(transient neurological syndrome，TNS)和馬尾綜合征是臨床上常見局麻藥神經(jīng)毒性反應(yīng)［1］。SH－SY5Y 細(xì)胞株來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤，該細(xì)胞繁殖快，細(xì)胞形態(tài)、生理和系列化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，因此該細(xì)胞是進(jìn)行人類神經(jīng)細(xì)胞研究較為理想的一種細(xì)胞模型［2］。本研究在SH－SY5Y 細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用MTT 法和流式細(xì)胞儀技術(shù)，觀察了不同濃度利多卡因?qū)H－SY5Y 細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡的影響，初步探討利多卡因的神經(jīng)毒性損傷作用。

材 料 和 方 法

1 材料

鹽酸利多卡因標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上海公司，Annexin V－FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BIPEC，SH－SY5Y 細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。主要儀器包括全自動(dòng)酶標(biāo)儀(雷勃公司)，分光光度計(jì)(GBC)，流式細(xì)胞儀(BD)等。

2 方法

2.1 SH－SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液內(nèi)(含有4.0 mmol/L 谷氨酰胺、4.5 g/L 的葡萄糖、100 mg/L 鏈霉素和100 U/L 青霉素)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約90%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理 實(shí)驗(yàn)分為4 組，即:正常培養(yǎng)組(對(duì)照組，未經(jīng)藥物處理);0.5%、1%、2%利多卡因組(L1、L2、L3 組，相當(dāng)于18.5 mmol/L、37 mmol/L、74 mmol/L 利多卡因處理細(xì)胞):分別用相應(yīng)濃度的利多卡因處理SH－SY5Y 細(xì)胞10 min。

2.3 觀察指標(biāo)

①SH－SY5Y 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 藥物處理10 min 后，在可見光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，評(píng)價(jià)細(xì)胞受損情況。

②MTT 法檢測(cè)SH－SY5Y 細(xì)胞相對(duì)活力 分別在藥物處理后5 min(T1)、10 min(T2)、藥物處理結(jié)束后15 min(T3)、藥物處理結(jié)束后12 h(T4)將細(xì)胞接種于96 孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞濃度為5 ×105cells/well，每孔加入MTT 溶液(5 g/L)10 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min 使結(jié)晶充分溶解，于酶標(biāo)儀檢測(cè)A570及A630值，計(jì)算A570與A630差值，并以正常培養(yǎng)組的差值1，其它各時(shí)點(diǎn)差值與其比值(%)為反映細(xì)胞活力的參數(shù)。

③細(xì)胞凋亡檢測(cè) 分別在藥物處理開始前(T0)、藥物處理后5 min(T1)、10 min(T2)、藥物處理結(jié)束后15 min(T3)、藥物處理結(jié)束后12 h(T4)將各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5 ×108cells/well，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL ，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h 時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。取SH－SY5Y 細(xì)胞，置于離心管中，以離心半徑10 cm、1 500 r/min 離心5 min，收集懸浮細(xì)胞。PBS 洗滌細(xì)胞2次后，以離心半徑10 cm、1 500 r/min 離心5 min，然后收集細(xì)胞。用400 μL 1 ×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液移至樣品試管中，加入5 μL Annexin V－FITC，輕輕混勻后于避光條件下室溫24 ℃孵育15 min。加入碘化丙啶10 μL，使終濃度為50 mg/L，染色5 min，24 ℃避光30 min 后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，每孔重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 細(xì)胞形態(tài)改變

倒置顯微鏡下見正常培養(yǎng)SH－SY5Y 細(xì)胞胞體粗大，呈多角形，出現(xiàn)樹突狀突起，神經(jīng)突起，多而粗大，分布成網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)出一系列神經(jīng)元的特征。實(shí)驗(yàn)組不同濃度的利多卡因處理10 min 后均對(duì)SH－SY5Y 細(xì)胞形態(tài)有明顯影響，細(xì)胞變圓，回縮，軸突漸消失，見圖1。

Figure 1. Morphocytology of SH－SY5Y cells (×100). C:SH－SY5Y were cultured under normal conditions;L1:SH－SY5Y were cultured with 0.5% lidocaine for 10 min;L2:SH－SY5Y were cultured with 1% lidocaine for 10 min;L3:SH－SY5Y were cultured with 2% lidocaine for 10 min.圖1 SH－SY5Y 細(xì)胞形態(tài)

2 細(xì)胞活力

各實(shí)驗(yàn)組不同濃度的利多卡因?qū)H－SY5Y 細(xì)胞活力均有明顯影響，利多卡因處理5 min 后，各組細(xì)胞活力明顯下降，且隨劑量增加，細(xì)胞活力下降明顯增加。2%利多卡因處理5 min 后，細(xì)胞活力下降至67%，處理10 min 后，細(xì)胞活力則下降為61%，停止利多卡因處理后15 min，細(xì)胞活力繼續(xù)下降至53%，停止處理后12 h，細(xì)胞活力則恢復(fù)至65%，見表1。

表1 各組SH－SY5Y 細(xì)胞活力的比較Table 1. Cell viability of the SH－SY5Y cells in each group(%. ±s.n=6)

表1 各組SH－SY5Y 細(xì)胞活力的比較Table 1. Cell viability of the SH－SY5Y cells in each group(%. ±s.n=6)

T1:treatment for 5 min;T2:treatment for 10 min;T3:15 min after treatment;T4:12 h after treatment. * P ＜0. 05 vs control group;#P ＜0.05 vs L1 group;△P ＜0.05 vs L2 group;▲P ＜0.05 vs T1 group.

Group T1 T2 T3 T4 Control 100 100 100 100 L1 87 ±2* 79 ±4＊▲ 70 ±4＊▲ 81 ±3＊▲L2 77 ±4* # 68 ±4* #▲ 61 ±3* #▲ 74 ±3* #L3 67 ±5* #△ 61 ±5* #△▲53 ±4* #△▲ 65 ±4* #△

3 細(xì)胞凋亡率

對(duì)照組細(xì)胞凋亡率在各時(shí)點(diǎn)保持在5.9% ～6.3%之間，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在利多卡因處理后各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率明顯增加，且隨著濃度的增加，細(xì)胞凋亡率也增加。2%利多卡因處理5 min、10 min 及停止利多卡因處理后15 min、12 h，細(xì)胞凋亡率分別為15.5%、23.0%、22.7%和19.3%，見表2。

表2 各組SH－SY5Y 細(xì)胞凋亡率的比較Table 2. Apoptotic rate of the SH－SY5Y cells in each group (%. ±s.n=6)

表2 各組SH－SY5Y 細(xì)胞凋亡率的比較Table 2. Apoptotic rate of the SH－SY5Y cells in each group (%. ±s.n=6)

T0:before treatment. * P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs L1 group;△P ＜0.05 vs L2 group;▲P ＜0.05 vs T0 group;OP ＜0.05 vs T1 group.

Group T0 T1 T2 T3 T4 Control 6.2 ±0.5 6.1 ±0.4 6.5 ±0.5 6.1 ±0.4 6.2 ±0.4 L1 6.3 ±0.5 10.4 ±1.3＊▲ 15.0 ±0.4＊▲O 14.5 ±1.5＊▲O 9.6 ±1.7＊▲L2 6.2 ±0.4 14.1 ±1.2* #▲ 19.2 ±1.2* #▲O 19.8 ±1.3* #▲O 15.2 ±0.5* #▲L3 5.9 ±0.4 15.5 ±0.9* #▲ 23.0 ±1.8* #△▲O 22.7 ±1.7* #△▲O 19.3 ±1.0* #△▲

討 論

局麻藥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性與其劑量、濃度和作用時(shí)間相關(guān)，即使在臨床常用濃度下，也常導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷，導(dǎo)致的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)與感覺功能損害多數(shù)在數(shù)小時(shí)或數(shù)天可完全恢復(fù)，少數(shù)恢復(fù)時(shí)間更長(zhǎng)，甚至為不可逆性。一項(xiàng)多中心研究發(fā)現(xiàn)，TNS 的發(fā)病率約為8.1%，表現(xiàn)為椎管內(nèi)阻滯完全恢復(fù)后早期出現(xiàn)燒灼樣、持續(xù)固定、痙攣性、放射性疼痛的癥狀，多發(fā)于軀干下部、一般為雙側(cè)，可沿下肢放射至其末端或背部［1］。馬尾綜合征發(fā)病率遠(yuǎn)低于TNS，但通常為永久性損害，表現(xiàn)為椎管內(nèi)阻滯恢復(fù)后，持續(xù)性肛周、骶尾區(qū)、雙下肢感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙。

局麻藥的神經(jīng)毒性作用的機(jī)制目前尚不完全明確，可能與以下幾方面有關(guān)。(1)神經(jīng)元興奮性增加［3－5］。局麻藥引起的暫時(shí)性神經(jīng)病學(xué)綜合征則表現(xiàn)為傳入神經(jīng)元興奮性增加引起的向雙下肢放射的臀部神經(jīng)病理性疼痛。研究表明，利多卡因可以使神經(jīng)細(xì)胞膜上的鈉離子通道發(fā)生重排，使細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度及細(xì)胞膜上鈉電流增加，神經(jīng)細(xì)胞的興奮性增加。(2)細(xì)胞內(nèi)鈣超載［6－8］。細(xì)胞內(nèi)鈣超載可導(dǎo)致線粒體膜電位的破壞和功能障礙，線粒體腫脹，功能失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鈣超載可使一些酶激活，引起膜磷脂的分解，在分解過程中產(chǎn)生游離脂肪酸、前列腺素、白三烯、溶血磷脂等，均對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。(3)p38 MAPK 途徑［9，10］。p38 MAPK的激活是細(xì)胞凋亡性死亡的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。研究表明，布比卡因神經(jīng)毒性損傷與p38 MAPK 的激活有關(guān)。

本研究選擇利多卡因的濃度分別為0.5%、1%和2%，均為臨床上常用的神經(jīng)阻滯濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，臨床常用濃度的利多卡因也可導(dǎo)致離體培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。本研究采用的是離體細(xì)胞培養(yǎng)模型，與在體研究存在比較大的差異。在整體實(shí)驗(yàn)中，制備局麻藥神經(jīng)損傷模型則需要較高濃度的利多卡因，通常達(dá)到5% ～10%，這可能與在體受多種因素如細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、神經(jīng)元的種類等因素影響有關(guān)。關(guān)于利多卡因的在體神經(jīng)損傷及其機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。但局麻藥神經(jīng)毒性損傷已經(jīng)成為神經(jīng)阻滯的常見不良反應(yīng)，且與局麻藥的濃度密切相關(guān)，因此在臨床工作中，在滿足臨床需要的同時(shí)，應(yīng)采用最低有效濃度，盡可能減少局麻藥的神經(jīng)毒性作用。

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