李巧霞， 韓冬艷， 叢 斌△， 單保恩， 張敬各

(1 河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，河北省法醫(yī)學實驗室，河北 石家莊050017;2河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院科研中心，河北 石家莊050011)

樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是機體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細胞(antigen－presenting cells，APCs)，在啟動和調(diào)節(jié)機體免疫應答過程中發(fā)揮極其重要的作用。正常情況下，機體內(nèi)大多數(shù)DCs 以非成熟狀態(tài)分布于外周組織和器官中，它們具有強大的抗原攝取能力，表達低水平主要組織相容性復合物II(major histocompability complex II，MHC II)分子和協(xié)同刺激分子，誘導T 細胞的能力較弱。一旦攝取抗原或接受某些因素刺激，DCs 逐漸發(fā)育成熟，細胞表面MHC 分子和協(xié)同刺激分子表達增高，通過向T 細胞提呈抗原、提供協(xié)同刺激信號和建立細胞因子微環(huán)境來激活初始T 細胞并誘導其向具有不同功能的亞群分化［1］。因此，DCs 的成熟狀態(tài)直接影響到T細胞介導的適應性免疫應答的性狀。

八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK－8)是一種典型的腦腸肽，通過細胞表面的CCK 受體(CCK－receptor，CCKR)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能。我們先前的系列研究表明CCK－8 能 夠 抑 制 脂 多 糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的巨噬細胞分泌促炎細胞因子和趨化因子，促進抗炎細胞因子白細胞介素10(interleukin－10，IL－10)的分泌;并能抑制活化的巨噬細胞表面分化群80(cluster of differentiation 80，CD80)和分化群86(cluster of differentiation 86，CD86)的表達，降低其抗原提呈時的協(xié)同刺激功能［2］。此外，CCK－8能夠調(diào)節(jié)LPS 誘導的B 細胞表面協(xié)同刺激分子表達和細胞因子分泌［3］。我們的最新研究表明，DCs 表面也表達CCKR，但CCK－8 對DCs 是否具有調(diào)節(jié)作用目前尚無報道。因此，本研究擬觀察CCK－8 對LPS 誘導DCs 成熟過程中細胞表型和功能改變的影響，以期進一步揭示CCK－8 的免疫調(diào)節(jié)作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

CCK－8、LPS 和FITC dextran 購自Sigma;重組鼠粒－ 巨噬細胞集落刺激因子(recombinant mouse GM－CSF)購 自RD;mouse CD11c (N418)MicroBeads、mouse CD4(L3T4)MicroBeads 和MS 分選柱購自Miltenyi Biotec;FITC anti－mouse CD80、PE anti－mouse CD86 和PE anti－mouse MHC class II 購自BioLegend;小鼠白細胞介素1β(interleukin－1β，IL－1β)、白細胞介素6(interleukin－6，IL－6)和腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor α，TNF－α)ELISA kit 購自北京晶美生物公司;其它試劑為國產(chǎn)分析純。

2 動物

健康無熱原C57BL/6 和BALB/c 小鼠，8 ～10 周齡，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，恒溫(23 ±2)℃，濕度45% ～65%，每天光照12 h。常規(guī)高壓滅菌飲食。實驗動物質(zhì)量合格證為704186。

3 小鼠骨髓來源DCs 的培養(yǎng)和純化

DCs 的培養(yǎng)參考Inaba 等［4］的方法，略作修改。無菌取C57BL/6 小鼠股骨和脛骨骨髓，制備單細胞懸液，裂解紅細胞，PBS 洗滌2 次后，用含15 μg/L GM－CSF 的RPMI－1640 完全培養(yǎng)液重懸細胞，接種于6 孔板，密度為(1 ～2)× 109cells/L、3 ～4 mL/well。第3 d，輕輕吸棄未貼壁細胞全量換液。第5 d，吸棄半量培養(yǎng)液，并補充該量。第6、7 d，收集懸浮和半貼壁細胞，加入mouse CD11c(N418)Micro Beads，采用Mini MACS 免疫磁珠分離系統(tǒng)分離純化DCs。

4 流式細胞分析檢測DCs 表型

收集純化DCs，調(diào)整細胞濃度為1 ×109cells/L，接種于24 孔板1 mL/well，分別進行以下分組處理:對照組(補加與實驗組等體積的細胞培養(yǎng)液);LPS組(加入LPS 終濃度為1 mg/L);LPS + CCK－8 組(加入LPS 終濃度為1 mg/L，再加入不同濃度的CCK－8 終濃度分別為10－6、10－8、10－10mol/L)。37℃、5%CO2孵育24 h，收集細胞，用PBS 洗1 次，分別加入FITC－抗CD80、PE－抗CD86 或PE－抗MHC II 抗體，4 ℃、避光孵育30 min，生理鹽水洗2次，流式細胞儀檢測。每次實驗用同型抗體作為對照。用平均熒光強度(mean channel fluorescence，MCF)表示CD80、CD86 和MHC II 蛋白表達量。

5 流式細胞分析檢測DCs 吞噬功能

純化DCs 按上述不同因素處理孵育24 h，收集細胞加入1 g/L FITC－dextran(40 kD)于37 ℃繼續(xù)孵育1 h，用PBS 洗2 次后，用流式細胞儀檢測FITC陽性細胞率。

6 ELISA 法檢測DCs 細胞因子表達

純化DCs 按上述不同因素處理24 h 后，收集培養(yǎng)上清，采用ELISA 試劑盒檢測小鼠IL－1β、IL－6和TNF－α 的含量。操作流程如下:采用倍比稀釋法獲得IL－1β、IL－6 和TNF－α 標準品。檢測板中每孔加入標準品或待測培養(yǎng)上清100 μL，37 ℃孵育90 min;PBS 洗板4 次;每孔加100 μL 生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min;PBS 洗板4 次;每孔加入酶結(jié)合物工作液100 μL，37 ℃孵育30 min;PBS 洗板4 次;每孔加入100 μL 顯色液，37℃避光孵育10－15 min;每孔加入100 μL 終止液混勻后，立即在450 nm 波長處檢測A 值。用標準品繪制標準曲線計算IL－1β、IL－6 和TNF－α 的含量。

7 MTT 法檢測T 細胞增殖反應

無菌取BALB/c 小鼠脾臟，制備單細胞懸液，裂解紅細胞后加入CD4(L3T4)MicroBeads，采用Mini MACS 免疫磁珠分離系統(tǒng)分離純化CD4+T 細胞，調(diào)整細胞濃度為1 ×109cells/L，以2 ×105cells/well CD4+T 細胞與上述不同因素處理的DCs 2 × 104cells/well(即CD4+T 細胞與DCs 比例為10∶1)共同接種于96 孔板中，每組設5 個復孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)72 h，每孔加入MTT 20 μL(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL/well，37 ℃振蕩10 min，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定570 nm 波長光吸收A值。

8 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.5 分析軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。各組間均數(shù)比較行單因素方差分析(ANOVA)，方差齊時用最小顯著差法(least significant difference，LSD)，方差不齊時用Dunnett T3 法作兩兩比較。

結(jié) 果

1 CCK－8 抑制LPS 誘導DCs 表面CD80、CD86和MHC II 表達

純化DCs 未加任何因素處理時細胞表面CD80、CD86 和MHC II 表達水平較低，LPS 刺激24 h 后，三者表達明顯升高(P ＜0.01);不同濃度CCK－8 與LPS 同時作用DCs 后，細胞表面CD80、CD86 和MHC II 表達明顯低于LPS 組(P ＜0.05，P ＜0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴關系，提示CCK－8 可抑制LPS 誘導的DCs 表型成熟，見圖1。

Figure 1. CCK－8 inhibited the expression of CD80，CD86 and MHC II on DCs induced by LPS. ±s. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs LPS group.圖1 CCK－8 抑制LPS 誘導DCs 表面CD80、CD86 和MHC II 表達

2 CCK－8 對LPS 誘導DCs 吞噬功能的影響

分離純化的DCs 未加任何因素處理時處于未成熟狀態(tài)，具有較強的吞噬FITC－dextran 的能力，LPS刺激24h 后，DCs 的吞噬功能減弱(P ＜0.01)，不同濃度CCK－8 與LPS 同時作用后，DCs 的吞噬能力較LPS 組明顯增強(P ＜0.01)，并呈劑量依賴關系，提示CCK－8 可以抑制LPS 誘導DCs 成熟，提高DCs的抗原攝取能力，見圖2。

Figure 2. Effect of CCK－8 on FITC－dextran uptake by DCs stimulated by LPS. ±s. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs LPS group.圖2 CCK－8 對LPS 誘導DCs 吞噬功能的影響

3 CCK－8 抑制LPS 誘導DCs 分泌細胞因子

純化未成熟DCs 自發(fā)產(chǎn)生TNF－α、IL－6 和IL－1β 的量非常低，低于試劑盒檢測的下限。LPS 孵育24 h 后，DCs 培養(yǎng)上清中TNF－α、IL－6 和IL－1β 的含量明顯增多(P ＜0.01);不同濃度CCK－8與LPS 同時作用則顯著降低了上述細胞因子的水平(P ＜0.01)，并呈劑量依賴關系，提示CCK－8 可顯著抑制LPS 誘導DCs 成熟，抑制其分泌細胞因子TNF－α、IL－6 和IL－1β，見圖3。

Figure 3. Effect of CCK－8 on cytokine production of DCs induced by LPS. ± s. n = 3. ＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs LPS group.圖3 CCK－8 對LPS 誘導DCs 分泌細胞因子的影響

4 CCK－8 處理DCs 對同種異體T 細胞增殖反應的影響

DCs 刺激同種異體小鼠脾T 淋巴細胞增殖反應的程度用A 值表示。未成熟DCs 刺激同種異體T 淋巴細胞增殖反應的能力較弱，經(jīng)LPS 誘導成熟的DCs 刺激同種異體T 淋巴細胞增殖反應的能力顯著增強(P ＜0.01)，CCK－8 與LPS 同時作用DCs 后，與LPS 組相比，DCs 刺激同種異體T 淋巴細胞增殖反應的能力明顯減弱，并呈劑量依賴效應(P ＜0.05，P ＜0.01)，提示CCK－8 可顯著抑制LPS 誘導DCs成熟，抑制其對T 淋巴細胞的協(xié)同刺激效應和抗原提呈能力，見圖4。

Figure 4. Effect of CCK－8 treatment DCs on proliferation of allogenic T－lymphocytes. ± s. n =5. ＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 ，△△P ＜0.01 vs LPS group.圖4 CCK－8 處理DCs 對同種異體T 淋巴細胞增殖的影響

討 論

DCs 廣泛分布于外周非淋巴組織(如皮膚、胃腸道和呼吸道)，參與機體抵抗外界病原體入侵的第一道防線，時刻監(jiān)視著機體環(huán)境中的各種外來因子，是針對包括細菌成分在內(nèi)的各種病原體引起免疫應答的主要調(diào)節(jié)者，在啟動和調(diào)節(jié)機體免疫應答過程中發(fā)揮極其重要的作用［5，6］。臨床上，以DCs 為基礎的疫苗在癌癥患者中已被用于誘導抗腫瘤免疫反應［7］，而在器官移植和自身免疫性疾病中已被用于誘導免疫耐受［8］。因此，決定DCs 誘導免疫反應還是誘導免疫耐受的因素已經(jīng)成為研究焦點。正常情況下，機體內(nèi)DCs 以非成熟狀態(tài)分布于外周組織和器官中，未成熟DCs 具有強大的攝取抗原的能力，它們表達低水平的MHC II 分子和協(xié)同刺激分子。已有研究證明這些未成熟的穩(wěn)定狀態(tài)的DCs 能夠通過誘導調(diào)節(jié)性T 細胞的產(chǎn)生或去除免疫效應T 細胞的活化來維持免疫耐受［9］。而成熟狀態(tài)的DCs 喪失了其抗原攝取能力，表達高水平的MHC II 分子和協(xié)同刺激分子，通過向T 細胞提呈抗原啟動適應性免疫反應［10］。在T 細胞極化的起始階段，DCs 通過向T細胞提呈抗原、提供協(xié)同刺激信號和建立細胞因子微環(huán)境來影響T 細胞的增殖和效應功能。因此，DCs依其成熟狀態(tài)而調(diào)控免疫應答，了解調(diào)控DCs 成熟與功能狀態(tài)的因素是防止不必要免疫應答的重要環(huán)節(jié)。

DCs 的成熟或激活主要通過兩條途徑［11］:(1)模式識別途徑:通過DCs 表面的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)來識別病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)而激活;(2)非模式識別途徑:通過對機體內(nèi)環(huán)境中自身分子和變化產(chǎn)生反應而激活。DCs 上的PRR 包括:Toll 樣受體(Toll－like receptor，TLR)、C 型凝集素受體(C－type lectin receptor，CLR)、雙鏈RNA 依賴的蛋白激酶(dsRNA－dependent protein kinase，PKR)等。LPS 是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分。已有研究證明，LPS 主要通過識別DCs 表面的TLR4 而激活DCs［12］，是體外實驗用于激活DCs 的主要途徑。

本文研究結(jié)果表明，1 mg/L LPS 孵育DCs 24 h后，可誘導細胞表面MHC II、CD80、CD86 表達顯著增加，并且把LPS 誘導的DCs 作為APC 與同種異體CD4+T 細胞共培養(yǎng)，可顯著提高CD4+T 細胞的增殖能力。表明LPS 可促進DCs 的表型和功能成熟，增強DCs 的協(xié)同刺激功能和抗原提呈能力，這些結(jié)果與文獻［13］報道一致:提示機體在細菌感染等因素作用下，樹突細胞的協(xié)同刺激活性及抗原呈遞能力增強，因此可能成為一些自身免疫性疾病如類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的誘發(fā)因素。當在LPS 刺激DCs 的同時加入CCK－8 共同作用，CCK－8 可以劑量依賴性地下調(diào)LPS 誘導樹突細胞表面MHC II 和CD80、CD86 的表達，這與CCK－8 對巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用相似［14］;且CCK－8 和LPS 共同孵育的DCs 作為APC 刺激同種異體CD4+T 細胞的增殖能力明顯下降，提示CCK－8 對LPS 誘導DCs成熟過程中的細胞表型和抗原提呈功能有抑制作用。此外，經(jīng)LPS 刺激后，DCs 大量分泌細胞因子IL－1β、IL－6 和TNF－α，這些細胞因子可以使DCs進一步活化，二者形成正反饋;并且，這些細胞因子可以誘導單核/巨噬細胞、T 細胞等的募集，從而導致局部炎癥反應的發(fā)生和加重。CCK－8 與LPS 同時作用DCs 后，可顯著抑制IL－1β、IL－6 和TNF－α的產(chǎn)生，這將有利于減緩炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展。目前有研究表明，血管活性腸肽和垂體苷腺酸環(huán)化酶激活肽通過下調(diào)LPS 活化的樹突細胞協(xié)同刺激活性和抗原呈遞能力，從而緩解了膠原誘導性關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展［15］。結(jié)合本文實驗結(jié)果，提示CCK－8可能通過對LPS 誘導DCs 成熟過程中細胞表型和功能的影響進而在抗感染和相關炎癥性疾病中發(fā)揮作用。

［1］ Delgado M，Reduta A，Sharma V，et al. VIP/PACAP oppositely affects immature and mature dendrtic cell expression of CD80/CD86 and the stimulatory activity for CD4+T cells［J］. J Leukoc Biol，2004，75(6):1122－1130.

［2］ 張風華，李淑瑾，叢 斌，等.CCK－8 對LPS 作用下巨噬細胞B7.1 和B7.2 表達及其協(xié)同刺激功能的影響［J］.中國藥理學通報，2007，23(10):1271－1275.

［3］ Zhang JG，Cong B，Li QX，et al. Cholecystokinin octapeptide regulates lipopolysaccharide－activated B cells costimulatory molecule expression and cytokines production in vitro［J］. Immunopharmacol Immunotoxicol，2011，33(1):157－163.

［4］ Inaba K，Inaba M，Romani N，et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colonystimulating factor［J］. J Exp Med，1992，176(6):1693－1702.

［5］ Rescigno M，Borrow P. The host－pathogen interaction:new themes from dendritic cell biology［J］. Cell，2001，106(3):267－270.

［6］ Lanzavecchia A，Sallusto F. Regulation of T cell immunity by dendritic cells［J］. Cells，2001，106(3):263－266.

［7］ Cerundolo V，Hermans IF，Salio M. Dendritic cells:a journey from laboratory to clinic［J］. Nat Immunol，2004，5(1):7－10.

［8］ Morel PA，F(xiàn)eili－Hariri M，Coates PT，et al. Dendritic cells，T cell tolerance and therapy of adverse immune reactions［J］. Clin Exp Immunol，2003，133(1):1－10.

［9］ Hawiger D，Inaba K，Dorsett Y，et al. Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady state conditions in vivo［J］. J Exp Med，2001，194(6):769－779.

［10］ Banchereau J，Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity［J］. Nature，1998，392(6673):245－252.

［11］ 徐 姍，姚詠明，盛志勇. 樹突狀細胞免疫調(diào)節(jié)作用及其信號轉(zhuǎn)導機制［J］. 生理科學進展，2006，37(4):313－318.

［12］ Xie J，Qian J，Wang S，et al. Novel and detrimental effects of lipopolysaccharide on in vitro generation of immature dendritic cells:involvement of mitogen－activated protein kinase p38［J］. J Immunol，2003，171(9):4792－4800.

［13］ De Smedt T，Pajak B，Muraille E，et al. Regulation of dendritic cell numbers and maturation by lipopolysaccharide in vivo［J］. J Exp Med，1996，184(4):1413－1424.

［14］ 張風華，李淑瑾，叢 斌，等. CCK－8 上調(diào)小鼠腹腔巨噬細胞B7.1 和B7.2 表達并增強其協(xié)同刺激活性［J］. 中國病理生理雜志，2007，23(4):776－779.

［15］ Chorny A，Gonzalez－Rey E，F(xiàn)ernandez－Martin A，et al. Vasoactive intestinal peptide induces regulatory dendritic cells with therapeutic effects on autoimmune disorders［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2005，102(38):13562－13567.