趙京山， 溫進坤， 韓 梅

(1 河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，河北 石家莊050091;2河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所，河北省醫(yī)學生物技術(shù)重點實驗室，河北 石家莊050017)

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一族在細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解中起主要作用的鋅離子依賴性蛋白酶超家族。在冠狀動脈粥樣硬化(coronary atherosclerosis，CAS)發(fā)生發(fā)展過程中，一方面，MMPs 可通過降解細胞外基質(zhì)和基底膜使內(nèi)皮屏障功能降低，促進脂蛋白在內(nèi)膜下沉積及炎癥細胞的浸潤;另一方面，通過降解ECM，影響粥樣斑塊的穩(wěn)定性，使斑塊破裂而誘發(fā)冠心?。?，2］。MMP -2 是MMPs 家族的重要成員，其作用底物主要有膠原、明膠、彈性蛋白、纖連蛋白、層黏連蛋白、蛋白聚糖、玻璃黏連蛋白等，而這些是構(gòu)成血管壁ECM 和基底膜的主要成分，因此，MMP-2 在CAS 斑塊形成和血管重構(gòu)中的作用受到研究者的重視［3，4］。近年研究表明，MMP -2 表達水平增高與CAS 的發(fā)生密切相關［5］。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在MMP－2 基因啟動子區(qū)的-735位存在單個堿基置換，胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)所取代，即C→T 變異，表現(xiàn)為C -735C、C -735T 和T-735T 3 種基因型。因該突變位點位于轉(zhuǎn)錄因子Sp1 結(jié)合的順式作用元件內(nèi)，故存在影響MMP－2 表達活性的可能性［6，7］。有報道指出C -735T 多態(tài)性與冠心病發(fā)病相關;也有一些學者得出相反的研究結(jié)論，這可能是由于他們研究所采用的人群不同所致［8，9］。迄今未見漢族人群MMP－2 基因啟動子區(qū)-735C→T 多態(tài)性與CAS 關聯(lián)性研究的文獻報道。我們應用聚合酶鏈反應和限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)，檢測了309 例經(jīng)冠狀動脈造影確診的CAS 患者和同期體檢311 名健康人MMP－2基因的-735C→T 多態(tài)性，旨在探討MMP－2 基因-735C→T 多態(tài)性與中國漢族人群CAS 的遺傳易感性和冠狀動脈狹窄程度的關系。

材 料 和 方 法

1 病例選擇

CAS 組(309 例，男203 例，女106 例)年齡45 ～82 歲，平均(59.5 ±13.1)歲。以河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院、石家莊市人民醫(yī)院2008 年12 月～2010 年8月住院行冠脈造影確診為CAS 的患者為研究對象;對照組來自這2 個醫(yī)院體檢中心健康體檢者(311例，男201 例，女110 例)，年齡44 ～85 歲，平均(61.6 ±12.9)歲。兩組男女構(gòu)成比及冠心病發(fā)病的主要危險因素包括吸煙、血壓、血脂等方面均無明顯差異，具有可比性。所有研究對象間均無血緣關系。CAS 組和對照組均空腹外周靜脈采血2 mL 并用EDTA 抗凝，用于基因組DNA 提取。病變嚴重程度根據(jù)冠脈造影結(jié)果進行分級，有散在斑塊，斑塊大小沒有超過管徑的50%記為0，斑塊大小超過管徑的50%，累及單支血管的記為1，累及2 支血管的記為2，累及3 支以上血管的記為3。

2 試劑

基因組DNA 小量抽提試劑盒SK1262 為上海生工公司產(chǎn)品，高保真DNA 聚合酶為BBI 產(chǎn)品，HinfⅠ內(nèi)切酶為New England Biolabs 產(chǎn)品，PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自Qiagen，PCR 引物由上海生工公司合成。

3 方法

3.1 DNA 抽提 取EDTA 抗凝的靜脈血0.5 mL，采用血液基因組DNA 小量抽提試劑盒，按操作說明書抽提DNA，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 PCR 擴增MMP－2 基因 C -735T 位點及其側(cè)翼區(qū):上游引物為5' - ATCCTGTGACGGAGAATG-3'，下游引物為5' - TAAAATGAGGCTGAGACC -3'，擴增片段長度為64 bp。PCR 反應體系為10 ×緩沖液2 μL ，dNTP(各10 mmol/L)1 μL。上、下游引物(各10 mmol/L)1 μL，DNA 模板0.1 μg，DNA 聚合酶2 U，加無菌雙蒸水至總體積20 μL。PCR 反應條件:95 ℃預變性5 min，94 ℃45 s，56 ℃30 s，72℃30 s，30 個循環(huán)，72 ℃10 min。反應結(jié)束后，經(jīng)12%PAGE 凝膠電泳，溴化乙啶染色后，用凝膠成像儀檢測PCR 產(chǎn)物特異性，采用PCR 純化試劑盒純化PCR 產(chǎn)物。

3.3 酶切反應 反應體系包括PCR 純化產(chǎn)物1 μg，10 ×緩沖液1 μL，HinfⅠ1.5 U，加雙蒸水至10 μL 體積;置37 ℃16 h，終止酶切反應，12%PAGE 凝膠電泳后，溴化乙啶染色，凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。

4 統(tǒng)計學處理

等位基因頻率計算:等位基因頻率=(2 ×純合子數(shù)+雜合子數(shù))/2 ×受檢人數(shù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(± s)表示。采用SPSS 10.0 軟件進行處理。用基因計數(shù)法計算CAS 組和正常對照組的基因型和等位基因頻率(構(gòu)成比)。各組基因型和等位基因頻率之間比較采用χ2檢驗。

結(jié) 果

1 臨床資料

對照組和CAS 組在性別、年齡、體重指數(shù)、血壓、吸煙史及吸煙之間均無顯著差異，見表1。CAS 典型的冠脈造影結(jié)果如圖1 所示。

2 基因型分析

PCR 擴增產(chǎn)物為64 bp 的DNA 片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化、限制性內(nèi)切酶Hinf I 酶切后，12%PAGE 凝膠電泳，溴化乙啶染色，凝膠成像儀檢測MMP－2 基因型。在野生純合子基因型(C-735C)，不存在Hinf I 的酶切位點，PCR 產(chǎn)物不能被切斷，只有64 bp 一個片段;當C-735 等位基因被T-735 等位基因取代(T-735T)時，則形成Hinf I 的酶切位點GANTC，PCR 產(chǎn)物經(jīng)Hinf I 酶切后形成43 bp 和21 bp 兩個片段;而僅一條染色體突變時(C -735T)時，則出現(xiàn)64 bp、43 bp 和21 bp 三個片段。因21 bp的DNA 片段較小，12%的凝膠電泳未能檢出，因此，經(jīng)PAGE 電泳后，CC 基因型可見64 bp 一條帶，CT 基因型為64 bp 和43 bp 兩條帶，TT 基因型為43 bp 一條帶，見圖2。

表1 對照組和CAS 組的臨床特征Table 1. Clinical characteristics in control group and CAS group(±s)

表1 對照組和CAS 組的臨床特征Table 1. Clinical characteristics in control group and CAS group(±s)

Clinical characteristics Control CAS P Sex Male 201 203 ＞0.05 Femal 110 106 Age (years) 61.6±12.9 59.5±13.1 ＞0.05 BMI 21.3±0.8 21.8±0.7 ＞0.05 BP(mmHg) 128.1±5.6 129.6±6.1 ＞0.05 Smoking status Non-smoker 132 137 ＞0.05 Smoker 170 172

Figure 1. Representative results of coronary artery visualization.A，B，C and D represent anterior descending branch，circumflex branch，anterior descending branch and circumflex branch，and right coronary artery branch stenosis，respectively.圖1 冠脈造影代表性結(jié)果

Figure 2. Electropherogram of the three genotypes of MMP－2 after cleavage. Lane 1:DNA marker;Lane 2:CC type;Lane 3:CT type;Lane 4:TT type.圖2 3 種基因型MMP－2 PCR 產(chǎn)物酶切后的電泳圖譜

3 不同基因型與CAS 組和冠脈病變程度之間的關系

如表2 所示，CAS 組與對照組CC 基因型頻率分別為86.1%和79.7%，CT +TT 基因型頻率分別為13.9%和20.3%，兩組差異顯著(χ2=4.398，P ＜0.05);C 等位基因頻率在CAS 組和對照組分別為92.6% 和89.1%，T 等位基因頻率為7.4% 和10.9%，兩組差異顯著(χ2=4.521，P ＜0.05)。從表3 可見，MMP－2 基因-735C→T 多態(tài)性對冠脈狹窄程度無明顯影響(χ2=1.553，P ＞0.05)。在CAS 組和對照組，MMP－2 基因-735C→T 多態(tài)性分布，經(jīng)χ2檢驗均符合Hardy -Weinberg 平衡，表明受檢者來自同一群體。

表2 MMP－2 三種基因型和等位基因頻率在CAS 和對照組中的分布Table 2. Distribution of the three genotypes and allele frequences of MMP－2 in CAS group and control group

表3 MMP－2 三種基因型與CAS 病變程度的影響Table 3. Effect of the three genotypes of MMP－2 on CAS

討 論

有研究表明，在冠狀動脈硬化患者中血漿中MMP-2 含量明顯升高，MMP-2 與粥樣斑塊的形成和發(fā)展有密切的關系［6，10，11］。MMP -2 又稱明膠酶A，是MMPs 家族的主要成員，因其作用底物是構(gòu)成血管壁基質(zhì)和基底膜的主要成分，因此，MMP -2 在冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成和血管重構(gòu)中的作用受到研究者的重視［2，3，6，12，13］。關于CAS 斑塊組織及患者血漿中MMP -2 水平升高的原因，一則可因斑塊組織受細胞因子刺激使MMP－2 基因表達活性升高而引起，二則可因MMP－2 基因，(尤其是表達調(diào)控區(qū))突變所致。

本文以309 例經(jīng)冠脈造影確診為CAS 的患者為研究對象，對MMP－2 基因啟動子區(qū)C -735T 進行檢測。結(jié)果提示，CAS 患者較對照組C 等位基因頻率偏高而T 等位基因頻率偏低，CC 基因型CAS 發(fā)病率較高，而CT+TT 基因型發(fā)病機率較低。以往的研究報道，MMP－2 基因啟動子區(qū)存在C -735T 基因多態(tài)性［6，7］，這一多態(tài)性位點正好位于轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合的順式作用元件區(qū)域，從而可影響Sp1 與其順式元件相互作用及MMP－2 基因的轉(zhuǎn)錄活性。本文結(jié)果提示，-735C→T 基因突變可能通過改變Sp1與順式作用元件的結(jié)合上調(diào)MMP -2 表達，而使基底膜和細胞外基質(zhì)降解加強，造成血管平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移，并吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞，加速粥樣斑塊的形成。但實驗結(jié)果還提示，MMP－2 基因-735-T 多態(tài)性與冠狀動脈狹窄程度無關，原因之一，可能是由于在病變晚期細胞外基質(zhì)的形成和降解趨于平衡，掩蓋了基因型的影響;原因之二，MMP－2 基因突變可上調(diào)MMP -2 表達，加速基底膜和細胞外基質(zhì)降解，有利于泡沫細胞在血管壁的聚集及動脈粥樣斑塊的形成，而這一機制在動脈粥樣斑塊形成的早期發(fā)揮的作用較明顯。在病變晚期MMP -2 的高表達，一方面，降解血管壁細胞外基質(zhì)促進動脈粥樣斑塊的形成;另一方面，在降解血管壁細胞外基質(zhì)的同時，也降解動脈粥樣斑塊內(nèi)的細胞外基質(zhì)使斑塊趨于減小，因此掩蓋了基因型對冠脈狹窄程度的影響所致。我們下一步將對確診的CAS 病例進行分期，從而進一步明確MMP－2 啟動子區(qū)C -735T 多態(tài)性與冠脈狹窄程度的關系。

總之，本研究結(jié)果提示，MMP－2 基因C -735T多態(tài)性與中國漢族人群CAS 有關，MMP－2 基因-735 bp的C 等位基因可能是CAS 遺傳易感性的基因標記之一;MMP－2 基因C -735T 多態(tài)性與CAS冠脈狹窄程度無關。本實驗還存在一些不足之處，如樣本量偏小。因此，繼續(xù)收集臨床病例擴大樣品量，繼續(xù)對本研究對象進行隨訪，尤其是對PTCA 術(shù)后再狹窄患者基因型的研究將有助于進一步了解MMP－2 基因多態(tài)性與CAS 的關系。

［1］ Ye S. Influence of matrix metalloproteinase genotype on cardiovascular disease susceptibility and outcome［J］.Cardiovasc Res，2010，69(3):636 -645.

［2］ 劉龍斌，郭航遠，史亞非，等.黃酒和紅葡萄酒抑制LDLR 小鼠MMP-2 表達和動脈粥樣硬化斑塊形成［J］.中國病理生理雜志，2010，26(4):676 -680.

［3］ Garcia-Touchard A，Henry TD，Sangiorgi G，et al. Extracellular proteases in atherosclerosis and restenosis［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，25(6):1119 -1127.

［4］ Jones CB，Sang DC，Herrington DM. Matrix metalloproteinases:A review of their structure and role in acute coronary syndrome［J］. Cardiovasc Res，2010，59(4):812-823.

［5］ Fitzsimmons PJ，F(xiàn)orough R，Lawrence ME，et al. Urinary levels of matrix metalloproteinase 9 and 2 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase in patients with coronary artery disease［J］. Atherosclerosis，2007，194(1):196-203.

［6］ Yu C，Zhou Y，Miao X，et al. Functional haplotypes in the promoter of matrix metalloproteinase-2 predict risk of the occurrence and metastasis of esophageal cancer［J］.Cancer Res，2010，64(20):7622 -7628.

［7］ Price SJ，Greaves DR，Watkins H. Identification of novel，functional genetic variants in the human matrix metalloproteinase -2 gene:role of Sp1 in allele -specific transcriptional regulation［J］. J Biol Chem，2001，276(3):7549-7558.

［8］ Newby AC. Dual role of matrix metalloproteinases (matrixins)in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture［J］. Physiol Rev，2005，85(1):1 -31.

［9］ Galis ZS，Khatri JJ. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis:the good，the bad and the ugly［J］. Circ Res，2002，90(3):251 -262.

［10］ Vanhoutte D，Schellings M，Pinto Y，et al. Relevance of matrix metalloproteinases and their inhibitors after myocardial infarction:a temporal and spatial window［J］. Cardiovasc Res，2006，69(3):604 -613.

［11］ Zeng B，Prasan A，F(xiàn)ung KC，et al. Elevated circulating levels of matrix metalloproteinase -9 and -2 in patients with symptomatic coronary artery disease［J］. Intern Med J，2005，35(6):331 -335.

［12］ Va?k A，Goldbergová M，Izakovi ová Hollá L，et al. A haplotype constituted of four MMP -2 promoter polymorphisms(- 1575G/A，- 1306C/T，- 790T/G and -735C/T)is associated with coronary triple-vessel disease［J］. Matrix Biol，2004，22(7):585 -591.

［13］ Lamblin N，Bauters C，Hemant X，et al. Polymorphisms in the promoter regions of MMP-2，MMP-3，MMP-9 and MMP-12 genes as determinants of aneurysmal coronary artery disease［J］. J Am Coll Cardiol，2002，40(1):43-48.