耿 翔， 周 奇， 劉 超， 尚 闖， 龐志剛△

(1 鄭州大學第二附屬醫(yī)院普外科，河南 鄭州450003;2 中山大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州510080)

肝癌作為一種常見的惡性腫瘤，嚴重危及人類的身心健康。全身化療作為肝癌綜合治療的重要組成部分，目前的臨床治療效果卻并不理想。這其中的原因既包括現(xiàn)有化療藥物藥效不佳、毒副作用大，又包括肝癌細胞易被誘導產(chǎn)生耐藥性等。因此尋求新的治療藥物、制定新的化療方案已成為當前肝癌治療的研究熱點［1］。研究發(fā)現(xiàn)2－脫氧－D－葡萄糖(2－deoxy－D－glucose，2－DG)作為一種糖酵解抑制劑，能夠通過影響腫瘤細胞能量的合成，達到抑制腫瘤細胞生長的作用［2］。本實驗中，我們觀察了2－DG與奧沙利鉑(oxaliplatin，L－OHP)單藥及聯(lián)合應用對人肝癌細胞SMMC－7721 增殖及凋亡的影響，以期能夠為肝癌的治療提供新的思路和實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌細胞SMMC－7721 由河南省腫瘤醫(yī)院中心實驗室贈與。四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl terazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethlsulfoxide，DMSO)和2－DG 均購自Sigma，L－OHP 為南京制藥廠出產(chǎn)，細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V－FITC/PI 購于聯(lián)科生物工程有限公司，caspase－3 試劑盒購于碧云天生物技術研究所。

2 方法

2.1 實驗分組 實驗分為空白對照組、2－DG 組、L－OHP 組及2－DG 聯(lián)合L－OHP 組。各實驗組除藥物劑量不同外培養(yǎng)環(huán)境相同。在檢測藥物對細胞的增殖抑制率時，將2－DG 按濃度分為6 mmol/L、12 mmol/L 和24 mmol/L 3 組;將L－OHP 按濃度分為10 μmol/L、20 μmol/L 和40 μmol/L 3 組;聯(lián)合用藥組也按濃度分為6 mmol/L 2－DG 聯(lián)合10 μmol/L L－OHP、12 mmol/L 2－DG 聯(lián) 合 20 μmol/L L－OHP、24 mmol/L 2－DG 聯(lián)合40 μmol/L L－OHP 3 組。在檢測細胞周期和凋亡率以及caspase－3 活性時，藥物濃度2－DG 均為12 mmol/L，L－OHP 均為20 μmol/L。

2.2 細胞培養(yǎng) SMMC－7721 細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度進行實驗。

2.3 MTT 法檢測細胞增殖抑制率 將SMMC－7721 細胞以3 ×104/well 密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期后加入各組藥物，每組設5 個復孔。加藥后分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，然后每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，隨后加入150 μL DMSO，振蕩10 min 后用酶標儀在490 nm 處測定各孔的吸光度(A)值，以計算細胞增殖抑制率。抑制率(%)=［(空白對照組A 值－實驗組A 值)/空白對照組A 值］× 100%。采用協(xié)同作用q 值［3］判斷2－DG和L－OHP 聯(lián)合應用的性質(zhì):q =EAB/(EA+EB－EA×EB)。式中EAB為兩藥合用抑制率，EA和EB為各藥單用抑制率，q ＞1.15 示兩藥有協(xié)同作用，0.85≤q≤1.15 示兩藥有相加作用，q ＜0.85 示兩藥有拮抗作用。

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率 調(diào)整細胞濃度為5 ×108/L，種植于6 孔板中。藥物處理48 h 后采用PI 染色法行細胞周期檢測:胰酶消化6 孔板中細胞后將其移至離心管中，加入PBS 液，1 000 r/min 離心10 min，前后離心2 次。室溫避光PI 染色30 min 后通過流式細胞儀檢測細胞周期。給藥48 h后采用Annexin V－FITC/PI 雙染色法行細胞凋亡率檢測:藥物作用48 h 后，消化、離心方法同前，加入1 mL binding buffer 后再加入10 μL Annexin V－FITC和5 μL PI，避光室溫反應15 min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.5 Caspase－3 活性測定 給藥處理24 h 后，收集各組細胞3 ×106個，600 r/min 于4 ℃離心5 min，收集細胞，吸除上清，PBS 洗滌1 次。加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4 ℃離心10 min 后把上清轉(zhuǎn)移到預冷的離心管中。加緩沖液混勻，加10μL Ac－DEVD－pNA (2 mmol/L)后混勻。37 ℃孵育100 min，酶聯(lián)免疫檢測儀在405 nm 處測定A 值。結果以吸光度(A)值的比值(實驗組A 值/空白對照組A 值)表示。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 MTT 檢測藥物對SMMC－7721 細胞生長的抑制作用

2－DG 和L－OHP 單藥及聯(lián)合用藥對肝癌細胞均具有增殖抑制作用。同一濃度不同時間，或同一時間不同藥物濃度，各組間抑制率相比較差異均顯著(P ＜0.05)，呈時間劑量依賴性;聯(lián)合用藥后3 個時段的協(xié)同作用q 值均＞0.85，提示兩藥具有協(xié)同、相加作用，見表1。

表1 2－DG 與L－OHP 對肝癌SMMC－7721 細胞的生長抑制率Table 1. The inhibitory rates of 2－DG and/or L－OHP on the growth of SMMC－7721 cells at different time points(%. ±s.n=6)

表1 2－DG 與L－OHP 對肝癌SMMC－7721 細胞的生長抑制率Table 1. The inhibitory rates of 2－DG and/or L－OHP on the growth of SMMC－7721 cells at different time points(%. ±s.n=6)

* P ＜0.05 vs other groups at the same time point;#P ＜0.05 vs the same group at 24 h.The numbers in the parentheses of combination group are q values.

Group 24 h 48 h 72 h Control 0 0 0 L－OHP(10 μmol/L) 17.47 ±6.91 28.66 ±2.51# 37.31 ±3.46#L－OHP(20 μmol/L) 43.96 ±1.16 51.76 ±1.01# 60.62 ±1.29#L－OHP(40 μmol/L) 56.23 ±0.89 75.29 ±2.05# 89.56 ±0.60#2－DG(6 mmol/L) 12.72 ±5.27 21.19 ±2.81# 33.29 ±1.73#2－DG(12 mmol/L) 25.95 ±1.71 32.11 ±1.62# 47.10 ±1.08#2－DG(24 mmol/L) 37.76 ±2.44 46.29 ±2.04# 73.20 ±7.05#L－OHP(10 μmol/L)+2－DG(6 mmol/L) 39.32 ±3.21* (1.40) 50.52 ±3.14* #(1.16) 69.53 ±1.43* #(1.17)L－OHP(20 μmol/L)+2－DG(12 mmol/L) 72.95 ±2.27* (1.24) 77.72 ±2.96* #(1.16) 91.66 ±0.28* #(1.15)L－OHP(40 μmol/L)+2－DG(24 mmol/L) 82.13 ±1.02* (1.16) 87.78 ±1.46* #(1.01) 94.40 ±0.13* #(0.97)

2 2－DG 和L－OHP 單藥及聯(lián)合用藥對SMMC－7721 細胞周期的影響

2－DG 單藥作用可使細胞周期阻滯于G2/M期。L－OHP 單藥應用主要使細胞阻滯于S 期。聯(lián)合用藥后，細胞被阻滯于S 及G2/M 期(P ＜0.05)，見表2、圖1。

Figure 1. Cell cycle determined by flow cytometry. A:control group;B:2－DG group;C:L－OHP group;D:2－DC + L－OHP group.圖1 流式細胞術檢測細胞周期

表2 2－DG 與L－OHP 對SMMC－7721 細胞周期及細胞凋亡的影響Table 2. The effects of 2－DG and/or L－OHP on the cell cycle and apoptotic rate of SMMC－7721 cells(%.±s.n=6)

表2 2－DG 與L－OHP 對SMMC－7721 細胞周期及細胞凋亡的影響Table 2. The effects of 2－DG and/or L－OHP on the cell cycle and apoptotic rate of SMMC－7721 cells(%.±s.n=6)

* P ＜0.05 vs control group.

Group G0/G1 S G2/M Apoptotic rate Control 77.91±3.68 15.60±1.73 6.49±1.61 1.10±0.13 2－DG(12 mmol/L) 57.64±3.32* 18.88±2.44 23.48±3.22* 19.00±1.22*L－OHP(20 μmol/L) 33.14±1.10* 55.87±2.32* 10.99±2.31 27.00±2.13*L－OHP(20 μmol/L)+2－DG(12 mmol/L) 25.57±3.52* 62.68±2.64* 11.75±1.91* 42.20±2.51*

3 2－DG 和L－OHP 單藥及聯(lián)合用藥對SMMC－7721 細胞凋亡的影響

2－DG 與L－OHP 單藥組的凋亡率大于對照組;聯(lián)合用藥組凋亡率大于單藥組，差異均顯著(P＜0.05)，見表2、圖2。

4 2－DG 及L－OHP 單藥聯(lián)合用藥對SMMC－7721 細胞caspase－3 活性的影響

應用caspase－3 活性試劑盒檢測caspase－3 活性，結果表明2－DG 作用于細胞后，caspase－3 的活性增加;而聯(lián)合用藥組則能夠誘導肝癌細胞SMMC－7721 的caspase－3 活性明顯增強，見表3。

Figure 2. Apoptosis detected by flow cytometry.A:control group;B:2－DG group;C:L－OHP group;D:2－DG+L－OHP group.圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡

表3 Caspase－3 活性的變化Table 3. The changes in caspase－3 activity(±s.n=3)

表3 Caspase－3 活性的變化Table 3. The changes in caspase－3 activity(±s.n=3)

* P ＜0.05 vs other groups.

Group Caspase－3 activity Control 1.00 2－DG(12 mmol/L) 1.53 ±0.07 L－OHP(20μmol/L) 1.93 ±0.10 L－OHP(20μmol/L)+2－DG(12 mmol/L) 2.60 ±0.05*

討 論

大多數(shù)正常細胞在有氧狀態(tài)下是以糖的有氧分解作為獲得能量的主要方式，只有在缺氧時才依靠無氧糖酵解供能。而腫瘤細胞卻與之不同。1924年，德國生物化學家奧托·海因里?！ね卟└?Otto Heinrich Warburg)發(fā)現(xiàn)并描述了腫瘤細胞的能量代謝特點，即腫瘤細胞即使在有氧條件下也會更傾向于通過無氧糖酵解的途徑來獲取能量，這便是著名的瓦博格效應(Warburg effect)［4］。隨著現(xiàn)代生物科學技術的發(fā)展，瓦博格效應的正確性以及在腫瘤細胞中的普遍性已經(jīng)逐步得到了證實［5］，盡管其確切的形成機制還未被闡明，但是它對腫瘤細胞的能量代謝特點的描述已經(jīng)為針對糖酵解途徑的靶向治療提供了理論依據(jù)和治療契機。

基于對瓦博格效應的理解，人們意識到如果對癌癥病人施以糖酵解抑制治療，則治療用藥將會更針對腫瘤細胞發(fā)揮作用，而對正常細胞影響較小。這樣的治療方式在突出靶向治療理念的同時，也通過不同于常規(guī)化療藥物的作用途徑達到治療腫瘤的目的。作為糖酵解抑制劑的一種，2－DG 潛在的抗癌效果正逐步得到人們的重視。有關研究顯示2－DG在進入細胞后，可被糖酵解的限速酶己糖激酶磷酸化為磷酸脫氧葡萄糖，從而競爭性地抑制己糖激酶與葡萄糖的反應，減少6－磷酸葡萄糖合成，限制糖酵解后續(xù)反應的發(fā)生，降低了糖酵解過程中的ATP 形成，通過影響細胞的能量代謝最終抑制細胞的生長［6］。已有研究顯示2－DG 對乳腺癌、胰腺癌等癌細胞的生長增殖都能起到較好的抑制作用［7、8］，其不僅可作為放射治療的輔助用藥提高放療的敏感性，而且在與順鉑、阿霉素、紫杉醇等常規(guī)化療藥物聯(lián)合應用時均能夠提高相關藥物的抗腫瘤作用。為進一步了解2－DG 對肝癌細胞的抑制效果以及其與化療藥物聯(lián)合應用對肝癌細胞增殖凋亡的影響，我們設計并開展了此次實驗。

實驗中我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的2－DG 均對肝癌細胞SMMC－7721 的生長具有抑制作用，并且這種抑制作用隨著藥物濃度和用藥時間的增加逐步提高。實驗中2－DG 能夠誘導SMMC－7721 細胞凋亡，并將細胞周期主要阻滯在DNA 合成的后期和有絲分裂期，我們考慮作為能量抑制劑的2－DG，其對腫瘤細胞的影響可能需要等到ATP 耗竭達到一定的程度時才會產(chǎn)生抑制作用，并誘導腫瘤細胞的凋亡。在實驗中2－DG 與L－OHP 聯(lián)合用藥組表現(xiàn)了較好的腫瘤抑制效果，兩藥顯示出了協(xié)同、相加效應。兩藥聯(lián)合應用后能阻滯SMMC－7721 細胞于S 期及G2/M 期，并較單藥組更好的誘導了肝癌細胞的凋亡?；熕幬飳NA 的破壞會造成與糖酵解有關的酶的合成減少，從而影響到腫瘤細胞自身的能量供應［9］;而由此以及糖酵解抑制所導致的能量生成減少又勢必會影響DNA 修復酶修復被破壞DNA 時對能量的需求。這樣一個惡性循環(huán)過程的形成，使不同作用機制的兩藥最終加速了細胞的死亡。

Caspase 家族是一類半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶?；罨腸aspase－3 作為該家族中的一員是凋亡過程中一個重要的執(zhí)行蛋白，對細胞凋亡的發(fā)生與調(diào)節(jié)起重要作用，其活性的表達與細胞凋亡程度呈現(xiàn)出正相關性［10］。在本實驗中，我們觀察到2－DG 作用于SMMC－7721 細胞后caspase－3 活性明顯高于對照組;同時2－DG 對L－OHP 誘導的細胞caspase－3 活性增加有明顯的促進作用。據(jù)此我們認為caspase－3 參與了2－DG 和L－OHP 誘導SMMC－7721 細胞凋亡的調(diào)控，通過其活性的激活最終導致了凋亡的增加。有關這一過程的具體作用機制目前還不明確，尚有待進一步的研究。

綜上所述，此次體外細胞實驗我們驗證了2－DG對肝癌細胞治療的有效性，也了解到其與化療藥奧沙利鉑合用應用所具有的協(xié)同效應，這些都讓我們?yōu)?－DG 潛在的臨床價值充滿期待。由于缺氧是實體腫瘤在體內(nèi)的常見狀態(tài)，同時缺氧條件下的肝癌細胞將會比常氧條件的細胞更傾向、更依賴無氧糖酵解來獲取能量，我們下一步的研究將會針對2－DG 單藥及與奧沙利鉑合用對缺氧狀態(tài)的肝癌細胞的影響以及進一步的體內(nèi)實驗而展開。

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