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二氯喹啉酸誘導(dǎo)煙草保護(hù)酶活性的動(dòng)態(tài)變化

2011-07-31 03:23陳澤鵬鄧建朝陳偉明萬樹青
中國(guó)煙草科學(xué) 2011年5期
關(guān)鍵詞:酸處理超氧化物二氯

陳澤鵬,鄧建朝,陳偉明,萬樹青*

(1.廣東省煙草公司,廣州 510600;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

二氯喹啉酸(Quinclorac)是由德國(guó)巴斯夫公司開發(fā)的新型喹啉酸類激素型除草劑,主要用于水稻插秧前后的稗草和其他雜草的防除,是我國(guó)稻田使用的主要除草劑[1-3]。由于二氯喹啉酸在土壤中的殘留時(shí)間較長(zhǎng),不易降解,因而對(duì)許多后茬敏感作物的生長(zhǎng)造成一定的影響。

1999—2002年,廣東省部分煙區(qū)出現(xiàn)煙草畸形生長(zhǎng)現(xiàn)象,結(jié)果造成烤煙品質(zhì)下降,受害嚴(yán)重的煙田無煙葉可收。后經(jīng)分析,致畸原因?yàn)橥寥乐袣埩舳揉醄4-6]。作者經(jīng)多次深入田間觀察發(fā)現(xiàn),凡畸形生長(zhǎng)的煙草田塊,很難找到受其他病害侵襲的煙株。為了弄清原因,在開展致畸機(jī)理研究的同時(shí),對(duì)畸形煙葉的耐病性因子也展開了一些探索。在二氯喹啉酸化學(xué)脅迫下,檢測(cè)煙草體內(nèi)保護(hù)酶特別是SOD和POD活性的變化,試驗(yàn)設(shè)計(jì)了二氯喹啉酸不同濃度、不同時(shí)間處理后煙草體內(nèi) SOD活性和POD活性動(dòng)態(tài)變化,以了解煙草畸形生長(zhǎng)與保護(hù)酶活性變化的關(guān)系,對(duì)深入了解二氯喹啉酸對(duì)煙草毒害效應(yīng)的機(jī)理以及誘導(dǎo)抗病性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草(Nicotiana tabacumL.)品種為 K326。溫室播種,育苗,于3~4片真葉期移栽。

供試藥劑為50%二氯喹啉酸可濕性粉劑,由江蘇新沂中凱農(nóng)用化工有限公司生產(chǎn)。采用盆栽法,在土中分別混入 0(CK)、1.04×10-3、2.08×10-3、4.17×10-3、8.33×10-3和 1.67×10-2mg/kg 二氯喹啉酸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定 參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)方法[7],稍作改動(dòng)。酶液制備:取第4片展開煙草葉片,去中脈,準(zhǔn)確稱取0.30 g(共3份)于預(yù)冷的研缽中,加入預(yù)冷的提取介質(zhì)1.5 mL(分3次加入,1次研磨,2次沖洗),在冰浴中研磨成勻漿,轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,-4 ℃13 000 rpm下冷凍離心20 min,上清液即為SOD粗提液。

顯色反應(yīng):取透明度好、質(zhì)地相同的試管,樣品測(cè)定管和對(duì)照管(一支遮光,2支照光),按表1加入試劑。

表1 顯色反應(yīng)試劑配置Table 1 The formula of color reaction reagent

混勻后,給1支對(duì)照管罩上比試管稍長(zhǎng)的雙層黑色硬紙?zhí)渍诠?,與其他各管同時(shí)置于4 000 lx紫外燈下反應(yīng) 5 min(要求各管照光情況一致,反應(yīng)溫度控制在 25~35 ℃之間,視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間)。

樣品超氧化物歧化酶活性的測(cè)定:

至反應(yīng)結(jié)束后,用黑布罩蓋上試管,終止反應(yīng)。以遮光的對(duì)照管作為空白,分別在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管的吸光度,按下式計(jì)算SOD活性。

式中:SOD總活性以每克鮮重酶單位表示。A0—照光對(duì)照管的光吸收值,As—樣品管的光吸收值,V1—樣液總體積(mL),VT—測(cè)定時(shí)樣品用量(mL),W—樣品鮮重(g)。

1.2.2 超氧化物歧化同工酶的測(cè)定 參照參考文獻(xiàn)[7]的方法。采用聚丙烯酰胺垂直板電泳技術(shù)。分離膠濃度為10%,濃縮膠為3%。電極緩沖系統(tǒng)pH 7.8磷酸緩沖液,酶的進(jìn)樣量30 μL,電泳是在4 ℃的冰箱中進(jìn)行,電泳時(shí)間為 4h。0顯色后照相,測(cè)量各酶帶的Rf值。

1.2.3 過氧化物酶(POD)活性測(cè)定 參照參考文獻(xiàn)[8]的方法。準(zhǔn)確稱取所測(cè)葉片0.3 g于預(yù)冷的研缽中,加入預(yù)冷的Tris2HCl緩沖液(pH 8.5)1.5 mL,冰浴中研磨成勻漿,轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中,-4℃,13 000 r/min 下離心20 min,取上清液分析。反應(yīng)體系中加入2.8 mL含18 mmol/L愈創(chuàng)木酚的磷酸緩沖液和0.1 mL的酶提液(對(duì)照用0.1 mL的磷酸緩沖液代替);最后再加入0.1 mL的1%雙氧水溶液。按酶活性連續(xù)記錄法用1 cm比色皿測(cè)定反應(yīng)體系在470 nm處的吸光度OD470;每個(gè)樣品重復(fù)3次,酶活性以單位鮮重葉片在單位時(shí)間內(nèi)光密度的變化值表示(OD/g?min)。根據(jù)處理和對(duì)照所測(cè)的酶活力的變化,計(jì)算酶活力影響率,即:酶活力抑制或激活率/%=[(對(duì)照酶活力-處理酶活力)/對(duì)照酶活力]×100。若所得值為負(fù)值,表明為激活效應(yīng)。

1.2.4 過氧化物同工酶測(cè)定 參考鄒琦的方法[7],采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術(shù)。濃縮膠濃度為3%,分離膠濃度7.5%,電極緩沖系統(tǒng)pH 8.3(Tris甘氨酸緩沖液),上樣量每孔30 μL,穩(wěn)壓電泳,在開始電泳時(shí),調(diào)節(jié)電壓80 V,0.5 h后變?yōu)?00 V。整個(gè)電泳過程在冰箱中進(jìn)行,歷時(shí)3~4 h。顯色后照相,測(cè)量各酶帶的Rf值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2000軟件處理,并用SAS國(guó)際通用統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù),對(duì)試驗(yàn)結(jié)果用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法(Duncan,s Muitiple Range Test,DMRT)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 二氯喹啉酸對(duì)煙草超氧化物歧化酶活性的影響

從圖1可以看出,移栽后14 d,二氯喹啉酸濃度為 1.04×10-3、2.08×10-3、4.17×10-3、8.33×10-3、1.67×10-2mg/kg處理煙草SOD活性較對(duì)照有升高趨勢(shì),分別較對(duì)照提高9.21%、32.60%、109.36%、136.16%、151.94%。移栽后 21 d,處理與對(duì)照差異不顯著。

圖1 二氯喹啉酸對(duì)煙草葉片SOD活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic reaction of SOD in tobacco treated with quinclorac

2.2 二氯喹啉酸對(duì)煙草超氧化物歧化同工酶的影響

從圖2看出,煙草的超氧化物酶帶有4條,相對(duì)遷移率 Rf分別為 0.49(Rf1)、0.55(Rf2)、0.58(Rf3)、0.63(Rf4)。不同濃度二氯喹啉酸處理煙草30 d的超氧化物酶活性較對(duì)照差異不顯著。

圖2 二氯喹啉酸處理煙葉30 d的超氧化物歧化酶凝膠電泳圖Fig.2 The electrophoretogram of SOD in tobacco treated with quinclorac after 30d

2.3 二氯喹啉酸對(duì)煙草過氧化物酶活性的影響

從圖3看出,當(dāng)移栽后28 d,不同濃度處理的煙草葉片酶活力達(dá)到一個(gè)峰值,對(duì)照和二氯喹啉酸濃度分別為 1.04×10-3、2.08×10-3、4.17×10-3、8.33×10-3和1.67×10-2mg/kg處理的煙草,其過氧化物酶活力分別為17.47、29.61、23.73、30.33、41.00、57.73 OD/(g?min-1),各處理的煙草葉片中過氧化物酶活性比對(duì)照分別提高69.47%、35.80%、73.61%、134.69%、230.45%。35 d所測(cè)結(jié)果表明,除1.67×10-2mg/kg濃度的煙草酶活力略有降低外,其他均呈上升趨勢(shì)(圖3),表明煙草經(jīng)二氯喹啉酸處理后,過氧化物酶的活力有所提高。

圖3 二氯喹啉酸對(duì)煙草葉片POD活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic reaction of POD in tobacco treated with quinclorac

2.4 二氯喹啉酸對(duì)煙草過氧化物同工酶的影響

從圖4看出,二氯喹啉酸不同處理與對(duì)照相比,煙根酶帶形態(tài)存在一定的差異。凡處理的煙草根共顯現(xiàn)9條酶帶,相對(duì)遷移率Rf分別為0.09(Rf1)、0.13(Rf2)、0.19(Rf3)、0.24(Rf4)、0.31(Rf5)、0.35(Rf6)、0.37(Rf7)、0.63(Rf8)、0.66(Rf9)。二氯喹啉酸處理的煙根與對(duì)照相比還新增一條酶帶 Rf1,且二氯喹啉酸處理后的酶帶顏色較對(duì)照明顯加深。隨著二氯喹啉酸施用量的增加,酶帶變寬,顯色加重,說明酶活性有所上升。二氯喹啉酸處理的煙葉誘導(dǎo)過氧化物同工酶活性與根所表現(xiàn)的活性趨于一致,不同的是誘導(dǎo)同工酶酶帶為10條[9]。

圖4 二氯喹啉酸處理煙草根的過氧化物酶凝膠電泳圖Fig.4 The electrophoretogram of POD in tobacco root treated with quinclorac

3 討 論

水稻與煙草輪作煙區(qū),由于水田施用二氯喹啉酸防除稗草,殘留土壤中的二氯喹啉酸可引起后茬煙草出現(xiàn)畸形生長(zhǎng)[4]。從畸形的形態(tài)分析,煙草葉面向內(nèi)褶,葉色加深,嚴(yán)重時(shí)葉面僅存葉脈而無葉肉組織。盆栽試驗(yàn)也表明,在不同濃度和時(shí)間下,二氯喹啉酸對(duì)煙草葉長(zhǎng)和葉寬具有顯著的抑制效應(yīng),這些癥狀表明,二氯喹啉酸對(duì)煙草致畸作用是與抑制細(xì)胞分裂有關(guān)。但這種畸形植株不會(huì)枯萎死亡,而同樣條件下的靶標(biāo)植物稗草可出現(xiàn)枯萎死亡現(xiàn)象。兩種植物對(duì)二氯喹啉酸表現(xiàn)出不同的中毒反應(yīng),表明煙草對(duì)二氯喹啉酸有一種解毒機(jī)制。通過檢測(cè)二氯喹啉酸對(duì)煙草兩種保護(hù)酶的反應(yīng)表明,在二氯喹啉酸長(zhǎng)時(shí)間的脅迫條件下,能誘導(dǎo)激活煙草保護(hù)酶的活性,測(cè)得不同濃度下,二氯喹啉酸隨著濃度升高,POD活性提高,在1.67×10-2mg/kg下,移栽28 d后可提高230%。SOD的活性在移栽后14 d達(dá)到峰值。由于保護(hù)酶具有清除自由基毒害的功能,在一定范圍內(nèi)減輕由此產(chǎn)生的氧自由基給機(jī)體造成的損傷,使之維持煙草生活的狀態(tài),POD和SOD在一定程度上活性都有升高,從而在清除煙草體內(nèi)自由基中起到重要的作用。

試驗(yàn)中二氯喹啉酸的化學(xué)脅迫使得煙草內(nèi)保護(hù)酶系(SOD和 POD)活性提高,而且畸形煙草幾乎未發(fā)現(xiàn)感染真菌和細(xì)菌病害。由此可以得出推論,二氯喹啉酸的化學(xué)脅迫可以誘導(dǎo)畸形煙草內(nèi)SOD和POD酶活性提高,同時(shí)增強(qiáng)了煙草抗病的能力。當(dāng)然保護(hù)酶系還包括苯并氨酸解氨酶(PAL),多酚氧化酶(PPO)等,要具體明確二氯喹啉酸與誘導(dǎo)抗病效應(yīng)之間的關(guān)系,還需要進(jìn)一步對(duì)二氯喹啉酸對(duì)PAL和PPO酶活性的影響進(jìn)行研究。該研究對(duì)于尋找誘導(dǎo)煙草抗病物質(zhì),提高植物潛在的抗病能力給了我們新的啟示。

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