劉慶輝，安 莉，石 敏，劉 巖，俞森洋 （解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京 100853）

急性缺氧性呼吸衰竭常需高濃度氧療，但高濃度氧療在改善機(jī)體供氧的同時(shí)也會引起肺結(jié)構(gòu)和功能的異常，即高氧肺損傷[1]。高氧暴露可直接刺激活性氧種類（reactive oxygen species, ROS）的生成并導(dǎo)致細(xì)胞活性的改變，造成肺泡上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損害，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷，可見氧化應(yīng)激反應(yīng)是高氧肺損傷重要機(jī)制之一[2]。目前對新生或幼年動(dòng)物的高氧肺損傷研究較多，而對成年動(dòng)物的相關(guān)研究較為少見[3]。本研究探討了成年大鼠高氧肺損傷發(fā)生的氧化應(yīng)激機(jī)制，并觀察了臨床常用藥物N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）預(yù)處理的影響，為探索防治高氧肺損傷的藥物提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

成年健康雄性清潔級SD大鼠48只（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重（302.2±12.8） g。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 48只大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只。5組置入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)氧艙（中國煙臺東科高壓氧設(shè)備有限公司）中吸入100%濃度氧氣，吸氧時(shí)間為24 h、48 h、72 h、96 h、96 h，作為24 h、48 h、72 h、96 h組和NAC干預(yù)組，并分別于0 h、24 h、48 h、72 h腹腔內(nèi)注射NAC（200 mg·kg-1）預(yù)處理。還有1組吸入空氣0 h作為0 h組。

1.2.2 標(biāo)本收集 到達(dá)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)后，將大鼠移出氧艙，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并抽取動(dòng)脈血。取出完整肺臟，稱取全肺濕重。取右肺組織一小塊用4%多聚甲醛溶液固定，剩余右肺組織立即放入凍存管，并置于液氮生物容器保存。肺組織勻漿制備：按每100 mg肺組織加入0.9 mL PBS（pH 7.4）的比例，冰浴下制成10%勻漿，3000 轉(zhuǎn)·min-1離心20 min，取上清液－20 ℃凍存。

1.2.3 觀察指標(biāo) 根據(jù)動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果計(jì)算氧合指數(shù)（PaO2/FiO2），測定肺系數(shù)評價(jià)肺水腫的程度。肺組織及血清中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）活性測定采用相應(yīng)的試劑盒。觀察肺臟組織病理學(xué)變化。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用chiss統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，所測數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

24 h、48 h組大鼠呼吸較為平穩(wěn)，口鼻紅潤；72 h組大鼠呼吸頻率增快，活動(dòng)減少；96 h組明顯呼吸窘迫，口唇紫紺明顯。同96 h組相比，NAC干預(yù)組大鼠呼吸困難程度明顯減輕，口唇僅有輕度紫紺。

2.2 氧合指數(shù)

0 h組、24 h組、48 h組的氧合指數(shù)分別為（452.98±8.10）、（453.23±10.50）、（451.36±16.60），三組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。72 h組氧合指數(shù)為（368.16±20.66），明顯下降，96 h組氧合指數(shù)為（123.39±11.46），達(dá)到最低值。NAC干預(yù)組氧合指數(shù)為（335.12±15.28），較96 h組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 肺系數(shù)

隨高氧暴露時(shí)間延長，大鼠肺系數(shù)呈逐漸增高趨勢，24 h組為（0.63±0.05），0 h組為（0.60±0.07），兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；72 h組為（0.85±0.06），與48 h組（0.65±0.05）相比，顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；96 h組為（1.05±0.12），達(dá)到高峰，NAC干預(yù)組（0.86±0.06）同96 h組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 肺組織和血清MDA含量

隨高氧暴露時(shí)間的延長，大鼠肺組織和血清MDA含量逐漸增高，96 h達(dá)到峰值。NAC干預(yù)組較96 h組顯著下降（見表1）。

表 1 六組大鼠肺組織和血清的MDA含量Tab 1 The contents of MDA in the lung and serum in six groups

2.5 肺組織和血清SOD活性

隨高氧暴露時(shí)間的延長，大鼠肺組織和血清SOD活性呈逐漸下降趨勢，96 h達(dá)到最低值。NAC干預(yù)組較96 h組SOD活性顯著增高（見表2）。

表 2 六組大鼠肺組織和血清SOD活性Tab 2 The levels of SOD in the lung and serum in six groups

2.6 肺組織和血清T-AOC活性

隨高氧暴露時(shí)間的延長，大鼠肺組織和血清T-AOC活性逐漸下降，96 h達(dá)到最低值。NAC干預(yù)組較96 h組T-AOC活性顯著升高（見表3）。

表 3 六組大鼠肺組織和血清T-AOC活性Tab 3 The levels of T-AOC in the lung and serum in six groups

2.7 肺組織病理學(xué)改變

正常對照組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤。隨著高氧暴露時(shí)間延長，肺泡壁增厚、結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，以96 h組病理學(xué)改變最為明顯。NAC干預(yù)組大鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞、炎性細(xì)胞浸潤及出血情況均較96 h組減輕。

3 討論

急性缺氧性呼吸衰竭的救治通常需要進(jìn)行高濃度氧療，以保證重要臟器的氧氣供應(yīng)，但高濃度氧是一把雙刃劍，在改善供氧同時(shí)也會引起機(jī)體肺結(jié)構(gòu)和功能的損害，即高氧肺損傷，輕者影響患者的生活質(zhì)量，重者可危及患者生命。對于早產(chǎn)或新生兒等正在發(fā)育中的肺組織，高氧甚至?xí)斐刹豢赡娴幕伟l(fā)育，導(dǎo)致慢性肺疾病如支氣管肺發(fā)育不良、肺氣腫等[1]。高氧誘導(dǎo)的急性肺損傷主要的特征是：炎癥細(xì)胞的聚集，肺組織通透性的增加以及血管內(nèi)皮和肺泡上皮細(xì)胞的損傷和/或凋亡[4]。進(jìn)一步探索高氧肺損傷的發(fā)病機(jī)制及探索相關(guān)的防治藥物具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。

生理狀態(tài)下體內(nèi)存在少量的氧自由基，但由于氧自由基清除劑的存在，機(jī)體并不會出現(xiàn)嚴(yán)重的組織損傷。高濃度氧暴露后可直接導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基及ROS產(chǎn)生明顯增多，造成肺泡上皮細(xì)胞的損傷，肺泡或間質(zhì)的巨噬細(xì)胞發(fā)生應(yīng)答，早期反應(yīng)的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β表達(dá)，從而活化肺內(nèi)宿主細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致趨化因子的產(chǎn)生，并通過一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)這種炎癥反應(yīng)過程[5-6]。目前對于成年動(dòng)物高氧肺損傷的研究較為少見，主要集中于新生或幼年動(dòng)物的相關(guān)研究，但不同年齡組動(dòng)物對高濃度氧的反應(yīng)存在明顯不同，細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放存在顯著差異[3]。本研究選擇成年大鼠作為研究對象，給予持續(xù)高濃度氧氣吸入，觀察成年大鼠高氧肺損傷的動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，能夠更好的模擬成年人高氧肺損傷的肺部損害機(jī)制。

我們的研究結(jié)果表明，隨著高濃度氧氣暴露時(shí)間的逐漸延長，實(shí)驗(yàn)大鼠的氧合指數(shù)呈逐漸下降趨勢，72 h出現(xiàn)顯著下降，提示大鼠在72 h開始出現(xiàn)肺部損害，96 h氧合指數(shù)達(dá)到ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)生嚴(yán)重的肺損傷。肺系數(shù)隨著吸入高濃度氧時(shí)間的逐漸延長呈逐漸增高趨勢，并于96 h達(dá)到高峰，反映機(jī)體肺組織水腫程度隨著高氧暴露時(shí)間的延長逐漸加重。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化而形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。肺是富含脂質(zhì)的器官，容易受到氧自由基的攻擊，形成脂質(zhì)過氧化物，脂質(zhì)過氧化物進(jìn)一步分解又能引起細(xì)胞的損傷[7]。本研究顯示：隨著高氧暴露時(shí)間的延長，肺組織和血清中MDA含量逐漸增加，96 h達(dá)到高峰，說明在高氧肺損傷時(shí)有大量的脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，這種氧化性損害持續(xù)存在，氧自由基與肺部脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化鏈鎖反應(yīng)所致。SOD是抗氧化酶類，SOD的高低可以間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力[8-9]。本研究顯示高氧暴露后SOD的活性逐漸下降，并持續(xù)存在于整個(gè)過程。高氧暴露后T-AOC逐漸下降，反映機(jī)體抗氧化能力下降。SOD、T-AOC活性下降和MDA含量升高反映了體內(nèi)氧化/抗氧化平衡的失調(diào)。氧化/抗氧化失衡可以進(jìn)一步引起蛋白質(zhì)損傷、DNA損傷、改變信號傳導(dǎo)通路、刺激轉(zhuǎn)錄因子活化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起肺組織的過度損傷。

N-乙酰半胱氨酸對多種呼吸道疾病如COPD、ARDS、肺間質(zhì)纖維化等具有較好的治療和預(yù)防作用[10]。作為一種氧自由基清除劑，在動(dòng)物試驗(yàn)中NAC能夠減輕LPS、氯氣、光氣等多種原因誘導(dǎo)所致的急性肺損傷[11-12]。已有研究表明，NAC通過誘導(dǎo)SOD的表達(dá)在一定程度上改善幼年或新生動(dòng)物的高氧肺損傷[13]，尚未檢索到NAC在成年動(dòng)物高氧肺損傷的研究報(bào)道，而成年動(dòng)物對高氧的病理生理反應(yīng)與幼年動(dòng)物不同[3]。我們的研究結(jié)果表明，NAC預(yù)處理后成年大鼠氧合明顯改善，肺水腫程度減輕，肺組織及血清中MDA水平顯著下降，SOD、T-AOC活性明顯改善，提示NAC具有改善氧合，減輕大鼠肺水腫程度，并通過抑制機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)在一定程度上減輕高氧所致成年大鼠急性肺損傷，為探討高氧肺損傷的藥物防治提供新的依據(jù)。

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