卜 強(qiáng),湯華明,談 健,胡 瀟,王東文

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科,山西太原,030001;2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 泌尿外科,江蘇鎮(zhèn)江,212001)

血小板源性生長(zhǎng)因子 -D(Platelet-derived growth factor,PDGF-D)是新近發(fā)現(xiàn)的 PDGF家族的新成員,特異性結(jié)合并激活二聚體受體PDGFRβ[1],從而發(fā)揮其生物學(xué)活性。目前發(fā)現(xiàn)PDGF-D參與胚胎的發(fā)育成熟、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲、血管生成等多種生物學(xué)活性,在腫瘤方面的研究已涉及前列腺癌、腎癌、肺癌、卵巢癌等[2-4],因而成為生長(zhǎng)因子家族的一個(gè)研究熱點(diǎn),有研究發(fā)現(xiàn),PDGF-D在膀胱移行細(xì)胞癌(BTCC)中高表達(dá),與膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[5],然而,關(guān)于 PDGF-D對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖及相關(guān)機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。PI3K/Akt信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管新生以及細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控[6],信號(hào)通路的激活常發(fā)生在惡變?cè)缙诤湍[瘤進(jìn)展期,同時(shí),信號(hào)通路激活程度也是腫瘤患者預(yù)后的重要指標(biāo)。因此,本研究選擇膀胱癌細(xì)胞株 T24,觀(guān)測(cè)外源性 PDGF-DD對(duì)其增殖及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,闡述 PDGF-DD誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌細(xì)胞 T24(上海拜力生物技術(shù)有限公司),小牛血清(杭州四季青公司),DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司),PDGF-DD為美國(guó) Peprotech公司產(chǎn)品,MTT、LY294002、PDTC、雷帕霉素(Sigma公司)。兔抗人 NF-κB p65多克隆抗體(Santa Cruz公司 ),兔抗人 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗體(Cell Signaling公司),羊抗兔 IgG(中杉公司)。酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司),流式細(xì)胞分選儀(FACSAria,BD公司)。其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人膀胱癌細(xì)胞 T24用含有 10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在 37℃、5%CO2且飽和濕度條件下培養(yǎng),隔天換液,待細(xì)胞生長(zhǎng)至約 80%融合時(shí),用 0.25%胰酶和 0.02%EDTA的混合消化液分散成單細(xì)胞,傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用上述消化液消化后制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),用 10%血清的 DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為 2.5×103/孔,接種于 96孔培養(yǎng)板上,置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后,換為無(wú)血清培養(yǎng)條件培養(yǎng) 24 h,之后分別加入終濃度為 (1、5、10、20、50、100 ng/mL)的 PDGF-DD蛋白,5%血清的培養(yǎng)液作為陽(yáng)性對(duì)照,無(wú)血清培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照,各組設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后,各孔加入 5 mg/mL的 MTT 20μL,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,吸除孔內(nèi)液體,各孔加入150μL DMSO,震蕩 10 min后,490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值,實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

將 T24細(xì)胞接種在 6孔板內(nèi),待細(xì)胞鋪滿(mǎn)板底達(dá) 60%時(shí),設(shè)置對(duì)照組,分別加入不同濃度的PDGF-DD(1、5、10、20、50、100 ng/mL), 培養(yǎng) 24 h后,收集細(xì)胞,用 PBS洗滌 2次,1 000 r/min,離心 5 min。加入 4℃預(yù)冷的 70%乙醇重懸固定,4℃過(guò)夜。1 500 r/min離心 10 min,去除乙醇。PBS洗滌 2次,1 000 r/min,離心 5 min,棄上清,用 1 mL PBS重懸細(xì)胞,加入 800μg/mL的RNase A 12.5μL,于 37℃水浴 30 min,加 1 mg/mL的碘化丙啶(PI)10μL混勻,4℃避光染 40 min,400目篩網(wǎng)過(guò)濾后,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 western blot檢測(cè)

將膀胱癌細(xì)胞接種到 6孔板中,不同濃度的PDGF-DD蛋白及各種抑制劑干預(yù)細(xì)胞后,常規(guī)提取細(xì)胞蛋白,以 10%SDS-PAGE電泳分離,4℃,90mA恒流轉(zhuǎn)膜過(guò)夜。結(jié)束后,取出 PVDF膜在 5%脫脂牛奶中室溫封閉 1 h。將膜以適量的一抗稀釋液 (Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR按 1:1000,NF-κB56抗體按 1∶500;GAPDH按 1∶1 000稀釋作為內(nèi)參),室溫下?lián)u床孵育 2 h,以HRP標(biāo)記的 IgG(1∶5 000)稀釋液,同條件孵育 1 h,每次孵育后用 TBS-T漂洗 3次,每次 10 min。用 ECL發(fā)光劑顯示陽(yáng)性條帶,并使用 GE公司的Typhoon 9400分子成像系統(tǒng)檢測(cè)和分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PDGF-DD對(duì) T24細(xì)胞增殖的影響

外源性 PDGF-DD蛋白在無(wú)血清培養(yǎng)條件下作用膀胱癌細(xì)胞 48 h后,采用 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,圖 1所示,不同濃度的 PDGF-DD對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有促進(jìn)作用,當(dāng)濃度≤20 ng/mL時(shí),隨著濃度的增加,促生長(zhǎng)作用也增加,而濃度大于 20 ng/mL時(shí),刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的作用開(kāi)始下降。與對(duì)照組相比(細(xì)胞生長(zhǎng)率為 100%),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,除 20 ng/mL與 50 ng/mL濃度之間外,各相鄰濃度之間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 PDGF-DD對(duì)膀胱癌細(xì)胞 T 24增殖的影響

2.2 PDGF-DD對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期的影響

T24細(xì)胞經(jīng) PDGF-DD作用 24h后,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的 PDGF-DD對(duì)細(xì)胞周期的影響,與無(wú)血清培養(yǎng)組相比,各濃度組 DNA合成前期(G0/G1期)的細(xì)胞比例下降,DNA合成期(S期)細(xì)胞比例上升,對(duì)細(xì)胞周期的影響具有濃度依賴(lài)性,當(dāng) PDGF-DD≥20 ng/mL時(shí),隨濃度的增加,對(duì)細(xì)胞周期的影響開(kāi)始下降,5～100 ng/mL組與無(wú)血清培養(yǎng)組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表 1。

表 1 PDGF-DD對(duì) T 24細(xì)胞周期的影響

2.3 PDGF-DD抑制 Akt信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

在無(wú)血清培養(yǎng)的條件下,選擇 10、20、50 ng/mL的 PDGF-DD處理細(xì)胞 24 h后,免疫印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá),印跡條帶上方數(shù)字為相對(duì)于對(duì)照組的灰度均值,T24細(xì)胞中 Akt、mTOR表達(dá)變化不明顯,而 p-Akt、p-mTOR及核蛋白 NF-κBp65的表達(dá)均明顯上調(diào),并且具有濃度依賴(lài)性,PDGF-DD濃度為 20 ng/mL時(shí)表達(dá)最高,與對(duì)照組相比,p-Akt、p-mTOR和 NF-κBp65的表達(dá)水平分別增加 2.3、2.4、2.8倍(圖 2)。

圖2 免疫印跡檢測(cè) Akt、mTOR、p-Akt、p-mTOR以及 NF-κBp 65的表達(dá)

2.4 抑制劑對(duì)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

含 5%血清培養(yǎng)的 T24細(xì)胞,在 PI3K抑制劑LY294002(20μmol/L)、NF-κB抑制劑 PDTC(20μmol/L)和 mTOR抑制劑雷帕霉素 (100 nmol/L)獨(dú)立或聯(lián)合作用 8 h,免疫印跡結(jié)果顯示,LY294002通過(guò)抑制 PI3K而降低 Akt及其下游蛋白的磷酸化,而 PDTC抑制 NF-κBp65的表達(dá),對(duì) p-mTOR的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響,相反,雷帕霉素只抑制 mTOR磷酸化,對(duì) NF-κBp65沒(méi)有明顯的影響。PDTC與雷帕霉素聯(lián)合作用可以抑制 mTOR和 NF-κB通路,表明 mTOR和 NF-κB是/Akt通路的下游靶位,而這兩條通路互為獨(dú)立。PDGF-DD對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能是通過(guò)Akt/mTOR和 Akt/NF-κB兩條獨(dú)立的通路實(shí)現(xiàn)的。

圖3 免疫印跡檢測(cè)各種抑制劑對(duì) T 24細(xì)胞 p-Akt、p-mTOR以及 NF-κBp 65蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)是由多種細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子,正常組織內(nèi) PDGF的分泌受到嚴(yán)格的調(diào)控,表達(dá)水平很低甚至完全檢測(cè)不到,PDGF-D是 PDGF家族中新發(fā)現(xiàn)的成員,PDGF-D已經(jīng)被證實(shí)在多種腫瘤高表達(dá),表達(dá)增強(qiáng)與腫瘤的分化程度及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PDGF-D通過(guò)特異性地與 PDGFRβ受體結(jié)合,激活下游的信號(hào)通路 ,如 PI3K/Akt、MAPK/ERK[7]等 ,對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性起調(diào)節(jié)作用。有研究表明用小分子干擾 RNA下調(diào) PDGF-D的表達(dá),通過(guò)使 Notch-1和 NF-κB信號(hào)通路失活而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成,減少了腫瘤細(xì)胞的侵襲力,反之用 cDNA轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào) PDGF-D的表達(dá)增加了腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲力,而且轉(zhuǎn)染 PDGF-DsiRNA的細(xì)胞VEGF表達(dá)水平下降[8]。目前,越來(lái)越多證據(jù)表明 PDGF家族新成員 PDGF-D在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),侵襲和血管生成中起著重要作用,然而,系統(tǒng)地研究其促細(xì)胞增殖及機(jī)制的報(bào)道尚少。本研究將外源性 PDGF-D作用膀胱癌細(xì)胞 T24,采用 MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖及周期的影響。

本研究結(jié)果顯示,外源性 PDGF-DD蛋白使膀胱癌細(xì)胞 T24活性增加,呈濃度依賴(lài)性,與無(wú)血清培養(yǎng)的對(duì)照組相比,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 1)。并且濃度為 20 ng/mL時(shí),對(duì)細(xì)胞的刺激作用最強(qiáng),相對(duì)于 5%血清培養(yǎng)組,刺激作用較弱。不同濃度的 PDGF-DD均可使細(xì)胞周期各時(shí)相分布發(fā)生變化,G0/G1期細(xì)胞數(shù)減少,S期細(xì)胞數(shù)增加,對(duì)其影響亦具有濃度依賴(lài)性。

PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,通過(guò)影響下游多種效應(yīng)分子的活化調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本功能,包括生存、生長(zhǎng)、增殖和代謝,與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。因此抑制該信號(hào)通路成為腫瘤預(yù)防和腫瘤靶向治療的熱點(diǎn)。PDGF-D通過(guò)其受體活化 Akt,進(jìn)而激活下游的mTOR,mTOR是 Akt的重要底物之一[9]。Akt通過(guò)直接和間接兩種途徑激活 mTOR,活化的mTOR可以引起腫瘤細(xì)胞的快速增殖、癌蛋白分泌增加、腫瘤周期加快、G1期時(shí)程縮短,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而,這條信號(hào)通路并非線(xiàn)性存在,而同時(shí)存在著數(shù)種串話(huà)(crosstalk)和反饋調(diào)節(jié)機(jī)制?；罨?Akt可以通過(guò) IKK-α及其他方式活化 NF-κB,NF-κB作為多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn),其激活參與炎癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等多種基因的表達(dá)調(diào)控。為了進(jìn)一步研究其促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制,我們利用 PI3K/Akt及其下游靶位蛋白的抑制劑獨(dú)立或聯(lián)合作用細(xì)胞,檢測(cè) Akt,mTOR及其磷酸化水平和 NF-κBp65表達(dá)的變化。結(jié)果表明,PDGF-DD通過(guò) PI3K/Akt信號(hào)通路 ,增加 p-Akt、p-mTOR、NF-κBp65蛋白的表達(dá),LY294002抑制 p-Akt及下游靶位蛋白的表達(dá),而 PDTC抑制 NF-κBp65的表達(dá),對(duì) mTOR沒(méi)有明顯的影響,與 PDTC類(lèi)似,雷帕霉素只抑制mTOR的磷酸化,PDTC與雷帕霉素聯(lián)合作用可以抑制 mTOR和 NF-κB通路,說(shuō)明,PDGF-DD活化 PI3K/Akt信號(hào)通路后,主要通過(guò) mTOR和NF-κB兩條獨(dú)立的通路實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)。

[1] Karvinen H,Rutanen J,Leppnen O,Lach R,Levonen AL,Eriksson U,Yl-Herttuala S.PDGF-C and-D and their receptors PDGFR-alpha and PDGFR-beta in atherosclerotic human arteries[J].Eur J Clin Invest,2009,39(4):320.

[2] Wang Z,Kong D,Li Y,Sarkar FH.PDGF-D signaling:a novel target in cancer therapy[J].Curr Drug Targets.2009,10(1):38.

[3] Wang Z,Ahmad A,Li Y,Kong D,Azmi A S,Banerjee S,Sarkar FH.Emerging roles of PDGF-D signaling pathway in tumor development and progression[J].Biochim Biophys Acta.2010,1806(1):122.

[4] Reigstad L J,Varhaug J E,Lillehaug J R.Structural and functional specificities of PDGF-C and PDGF-D,the novel members of the platelet-derived growth factors family[J].FEBS J,2005,272(22):5723.

[5] 董 銳,朱朝輝,呂 磊,萬(wàn) 鋒.血小板源性生長(zhǎng)因子-D在膀胱癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志.2010,27(3):287.

[6] Sun Z J,Chen G,Zhang W,Hu X,Liu Y,Zhou Q,Zhu LX,Zhao YF.Curcumin dually inhibits both mTORand NF-κB pathways through a crossed/Akt/IKK signaling axis in adenoid cystic carcinoma.Mol Pharmacol.2010 Oct 19.[Epub ahead of print]

[7] Ammoun S,Flaiz C,Ristic N,et al.Dissecting and targeting the growth factor dependent and growth factor independent extracellular signal regulated kinase pathway in human schwannoma[J].Cancer Res,2008,68(13):5236.

[8] Zhao L,Zhang C,Liao G,Long J.RNAi-mediated inhibition of PDGF-D leads to decreased cell growth,invasion and angiogenesis in the SGC-7901 gastric cancer xenograft model[J].Cancer Biol Ther,2010,9(1):42.

[9] Kong D,Banerjee S,Huang W,Li Y,Wang Z,Kim HR,Sarkar FH.Mammalian target of rapamycin repression by 3,3'-diindolylmethane inhibits invasion and angiogenesis in platelet-derived growth factor-D-overexpressing PC3 cells[J].Cancer Res,2008,68(6):1927.