宋增芳,廖月霞,肖煒明,吳克艷,胡 榮,朱海航,趙 梁,卜 平

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州,225001)

半枝蓮是一種常見的抗腫瘤中藥,其毒副作用小且有祛邪固本的功效,半枝蓮的水提取物和醇提取物均有明顯的抗肺癌、消化系統(tǒng)癌、乳腺癌、絨膜上皮癌的活性[1-2]。作者的前期實(shí)驗(yàn)研究證明半枝蓮提取物劑量依賴性地抑制腫瘤的生長,同時在一定程度上提高了機(jī)體的免疫力。但關(guān)于半枝蓮水煎劑及半枝蓮水提取物的體內(nèi)抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制尚未明確。作者就半枝蓮水提取物的體內(nèi)抗腫瘤及其對免疫的雙向調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了初步研究,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

半枝蓮(生):產(chǎn)地江蘇,生產(chǎn)批號901008116,生產(chǎn)許可證號:皖 Y20050032,生產(chǎn)日期:2009年 9月 3日,購于北京同仁堂(亳州)飲片有限責(zé)任公司);95%乙醇(揚(yáng)州市金山化工有限公司);石油醚(分析純)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);參一膠囊(人參皂甙 Rg3)(吉林省亞泰制藥股份有限公司);VEGF兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));S100兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));即用型 SABC免疫組化試劑盒 -兔 IgG(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及瘤株

BALB/C小鼠 90只,清潔級,體質(zhì)量 18～22 g,雄性,由揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房提供。S180腹水小鼠:購于江蘇省腫瘤醫(yī)院。

1.3 儀器

SENCOR203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SENCO W201B型恒溫水浴鍋上海申生科技有限公司產(chǎn)品。電熱干燥箱 202-2型,東臺電器廠。電子天平DT500,常熟市百靈天平儀器有限公司。電子天平 MP200A,上海市第二天平儀器廠。

2 方 法

2.1 半枝蓮提取物的制備

本實(shí)驗(yàn)所用的半枝蓮提取物包括半枝蓮水提取物和半枝蓮水煎劑兩種。

半枝蓮水提取物:將半枝蓮全草 6 kg晾干、粉碎,以石油醚在 60℃水浴條件下回流提取 2次,每次 2 h[3]后放入通風(fēng)櫥中將石油醚揮發(fā)干凈。用水提取,溫度 90℃,時間 3 h,固液比 1:12,提取 3次[4]。合并濾液,將其用離心機(jī)以 4 000 r/min離心 18 min,濃縮上清液[5]。向濃縮液中緩慢加入 3倍體積的 95%乙醇,靜置過夜,可見絮狀沉淀析出。4 000 r/min離心 20 min左右,收集沉淀,在70℃烘箱干燥即得到未脫蛋白粗多糖,得率約為 1.29%。

半枝蓮水煎劑的制備:稱取半枝蓮 200 g,加相當(dāng)于藥材量的 5～7倍的水浸泡 1～2 h,煮沸30 min,過濾,藥渣加水繼續(xù)煎煮 30 min,過濾,合并濾液,于水浴上濃縮成每毫升相當(dāng)于原生藥材 1 g的半枝蓮水煎劑[6]。

2.2 半枝蓮水提取物對 S180荷瘤小鼠瘤重的影響

2.2.1 建立小鼠模型:將 BALB/C小鼠隨機(jī)分為8組,每組 10只。無菌條件下抽取接種 7d的生長良好的 S180荷瘤小鼠腹水(臺盼藍(lán)染色顯示活癌細(xì)胞數(shù) >95%),用無菌生理鹽水(體積比)1:4稀釋,在小鼠右前腋部皮下接種,每只 0.2 mL,于 30 min內(nèi)接種完成。

2.2.2 給藥:于小鼠接種 24 h后開始給藥,每日1次,共 7 d。Ⅰ組為模型對照組,給予 0.9%生理鹽水,0.1 mL/10 g,灌胃;Ⅱ組參一膠囊(人參皂甙 Rg3)組,劑量為 5.2 mg/kg,0.1 mL/10 g,灌胃;Ⅲ組為空白組(未接種腫瘤),給予 0.9%生理鹽水,0.1 mL/10 g灌胃;Ⅳ組為半枝蓮水煎劑高劑量組,半枝蓮水煎劑的濃度為 0.8 g/L,按0.2 mL/10 g灌胃;Ⅴ組半枝蓮水煎劑中劑量組,按 0.1 mL/10 g灌胃;Ⅵ組為半枝蓮水煎劑低劑量組,按 0.05 mL/10 g灌胃;Ⅶ組為半枝蓮粗水提取物高劑量組,200 mg/(kg·d),配置濃度為0.2 g/10 mL,按 0.1 mL/10 g灌胃;Ⅷ組為半枝蓮水提取物中劑量組,100 mg/(kg·d),配置濃度為 0.1 mL/10 g,按 0.1 mL/10 g灌胃;Ⅸ組為半枝蓮水提取物低劑量組,50 mg/(kg·d),配置濃度為 0.05 g/10 mL,按 0.1 mL/10 g灌胃。將 90只雄性小鼠常規(guī)飼養(yǎng),自由飲水進(jìn)食,實(shí)驗(yàn)室溫度 22～25℃,相對濕度 60%～70%,并保持良好的光照和通風(fēng)條件,每天固定時間段記錄小鼠的體重及活動情況[7-8]。給藥 7 d后停藥,停藥后次日處死小鼠,處死小鼠的前夜予以禁食,但不禁水。

2.2.3 測抑瘤率:停藥次日處死,稱取小鼠瘤重[9]。

2.3 半枝蓮水提取物對 S180荷瘤小鼠胸腺、脾臟、肝臟的影響

實(shí)驗(yàn)動物模型制造方法同 2.2,給藥劑量及途徑也相同。末次給藥后 24 h處死,分別稱取體重、胸腺、脾臟及肝臟的重量,按公式計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)[10]。

胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺重/體重

脾指數(shù)(mg/g)=脾重 /體重

肝指數(shù)(mg/g)=肝重 /體重

2.4 半枝蓮提取物對 S180移植瘤小鼠瘤體中VEGF及 DC的影響

實(shí)驗(yàn)動物模型制造方法及給藥劑量與途徑按2.2進(jìn)行。給藥 7 d后停藥,停藥后次日處死小鼠,摘取腫瘤組織,固定、包埋、切片后用免疫組化法測定腫瘤組織中 VEGF及 DC的表達(dá)情況使用JEDA801D形態(tài)學(xué)圖像系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。免疫組化染色評分按 Rahman[11]等的方法進(jìn)行。

3 結(jié) 果

3.1 半枝蓮水提取物對 S180小鼠表現(xiàn)出不同的抑瘤作用

對 S180小鼠瘤重的影響(表 1),半枝蓮提取物對 S180小鼠表現(xiàn)出不同的抑瘤作用。與模型組比較高、中劑量組表現(xiàn)出良好的抑瘤效果,有顯著性差異(P<0.01),低劑量有差異(P<0.05),與陽性對照比較,中劑量組與參一膠囊組比,抑瘤率有明顯升高。

表 1 藥物對 S180移植瘤小鼠瘤重的影響

3.2 半枝蓮水提取物對 S180荷瘤小鼠肝指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響

半枝蓮提取物對 S180荷瘤小鼠肝指數(shù)、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響如表 2所示,與模型組比較半枝蓮提取物中、低劑量組胸腺指數(shù)都有顯著提高,而高劑量組明顯受到抑制,且差異顯著(P<0.05或 <0.01)。各用藥組脾指數(shù)均較模型組有所提高,其中半枝蓮提取物高、中劑量組脾臟指數(shù)均較模型組顯著提高(P<0.05或 <0.01),半枝蓮水煎劑中劑量組脾指數(shù)較參一膠囊陽性對照組有顯著提高(P<0.05)。各用藥組肝指數(shù)均較模型組有所提高,其中半枝蓮提取物高、中劑量組肝臟指數(shù)均較模型組有顯著提高(P<0.05或 <0.01),各用藥組肝指數(shù)與參一膠囊組相比較無差異。

表 2 半枝蓮提取物對 S180荷瘤小鼠肝指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的響

3.3 半枝蓮水提取物對 S180移植瘤小鼠瘤體中VEGF及 DC的影響

VEGF陽性反應(yīng)細(xì)胞的胞漿被染成棕黃色,背景呈淺黃色或不著色。每張切片隨機(jī)選取 5個視野(放大倍數(shù)為 200),進(jìn)行免疫組化染色評分。免疫組化染色評分標(biāo)準(zhǔn)是:根據(jù)著色細(xì)胞的比例(染色范圍)及染色強(qiáng)度評分,染色范圍(陽性細(xì)胞比率)分為 0～4級,陰性為 0分;陽性細(xì)胞0～25%為 1分;陽性細(xì)胞 26% ～50%為 2分;陽性細(xì)胞 51% ～75%為 3分;陽性染色 76% ～100%為 4分。染色強(qiáng)度劃分為 0～3級;陰性為0分;弱陽性為 1分;中等強(qiáng)度為 2分;強(qiáng)陽性為 3分,兩者得分相加為最后評分。模型組陽性率最高,以半枝蓮水煎劑中劑量組的陽性率最低。

S100蛋白位于細(xì)胞的胞漿及胞核中,S100陽性細(xì)胞的胞漿染成棕黃色,胞核也可見著色,我們將細(xì)胞形態(tài)可辨且不規(guī)則,胞漿胞核均染色的細(xì)胞才計(jì)數(shù)為 S100陽性的樹突狀細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取 5個視野(放大倍數(shù)為 400),觀察并計(jì)數(shù)樹突細(xì)胞,計(jì)算每個高倍視野的樹突狀細(xì)胞平均數(shù)。模型組未見有陽性細(xì)胞浸潤,以半枝蓮水煎劑中劑量組的陽性率最高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表 3),半枝蓮水提取物給藥劑量不同,VEGF在小鼠 S180肉瘤組織內(nèi)表達(dá)有區(qū)別,半枝蓮各用藥組 VEGF表達(dá)評分均較模型組有所下降,半枝蓮水煎劑三個劑量組及半枝蓮水提取物中、低劑量組均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);并且半枝蓮水煎劑高、中劑量及半枝蓮水提取中劑量組對小鼠 S180肉瘤組織內(nèi)VEGF表達(dá)的抑制程度較陽性藥物人參皂甙 Rg3更為強(qiáng)大。半枝蓮水提取高劑量組與模型組比較無差異。

模型組未見有 S100陽性樹突狀細(xì)胞細(xì)胞的浸潤,而各用藥組則見不同程度的浸潤,其中以半枝蓮水提取物高、中劑量組的浸潤密度最為突出,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

由表 3中數(shù)據(jù)可以看出,各用藥組 VEGF表達(dá)的評分越低,樹突狀細(xì)胞的浸潤密度則相對越高。故而將各組的 VEGF表達(dá)與樹突狀細(xì)胞浸潤密度進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示(圖 1):VEGF表達(dá)與DC浸潤密度之間呈顯著性負(fù)相關(guān)(r=-0.595,P<0.01)。

表 3 VEGF和 S100在小鼠瘤體中表達(dá)情況

圖1 VEGF表達(dá)與 DC浸潤密度的相關(guān)性分析

4 討 論

研究表明,VEGF一方面能促進(jìn)腫瘤的血管生成,另一方面 VEGF是 DC生成和成熟的重要負(fù)調(diào)控因子,VEGF能抑制DC的分化及 imDC的功能性成熟,VEGF抑制 mDC行使功能,從而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答,使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視[12]。而 DC能夠介導(dǎo) VEGF生成。兩者相互影響,形成惡性循環(huán),導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展、惡化、轉(zhuǎn)移?？闪13]通過實(shí)驗(yàn)證明半枝蓮多糖可上調(diào)H-22小鼠血清中 IL-2、IL-12、TNF-a的表達(dá)、下調(diào) VEGF的表達(dá)。作者認(rèn)為半枝蓮提取物或許通過在體內(nèi)下調(diào) VEGF及上調(diào) DC的雙向調(diào)節(jié),進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫。

中藥作為免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)劑,在提高機(jī)體免疫功能、抗腫瘤方面起著越來越重要的作用,在腫瘤臨床治療上有著廣闊的應(yīng)用。隨著現(xiàn)代腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展,已經(jīng)認(rèn)識到 DC的數(shù)量及功能正常與否是機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要條件,因此 DC可能是中藥影響免疫功能的關(guān)鍵所在。DC可以合成和分泌 S100蛋白,目前許多文獻(xiàn)報道 S100蛋白標(biāo)記了包括成熟的以及不成熟的所有樹突狀細(xì)胞[14]。S100陽性樹突狀細(xì)胞在抗腫瘤免疫中被認(rèn)為是先趨向于被機(jī)體視為異物的腫瘤周圍[15],再逐漸移入腫瘤細(xì)胞之間,通過它的樹突與腫瘤細(xì)胞密切接觸后獲得抗原,再移行到局部淋巴結(jié),將腫瘤抗原呈遞給 T細(xì)胞,發(fā)揮 T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用而殺傷破壞腫瘤細(xì)胞,形成免疫監(jiān)視。通過腫瘤組織內(nèi) S100的表達(dá)情況可以了解樹突狀細(xì)胞的浸潤情況,從而間接了解腫瘤的免疫微環(huán)境狀況。

在實(shí)驗(yàn)中,作者發(fā)現(xiàn)還隨著半枝蓮水提取物給藥濃度的變化,VEGF在小鼠 S180肉瘤組織內(nèi)的表達(dá)越強(qiáng),DC的浸潤密度卻越小,而且 VEGF表達(dá)與 S100陽性 DC浸潤密度之間呈顯著性負(fù)相關(guān),VEGF表達(dá)的評分越高,樹突狀細(xì)胞的浸潤密度則相對越低。學(xué)者們通過大量實(shí)驗(yàn)推斷,腫瘤分泌的 VEGF通過抑制 HPC中 NF-κB活化,進(jìn)而降低核內(nèi) h10組蛋白基因的表達(dá),從而影響HPC分化成為成熟 DC。Mimura等[16]通過體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),VEGF劑量依賴性地抑制 mDC激活同種異體 T細(xì)胞的能力。而且 VEGF誘導(dǎo)的mDC功能障礙主要由 VEGFR2所介導(dǎo)。Webster等發(fā)現(xiàn) DC能激發(fā)淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生長,同時伴隨淋巴結(jié)內(nèi) VEGF水平升高,Lu等[17]在沒有淋巴細(xì)胞的小鼠體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)存在這種現(xiàn)象。張義[18]通過實(shí)驗(yàn)表明在肝細(xì)胞肝癌組織中VEGF表達(dá)和 DC浸潤程度呈負(fù)相關(guān),VEGF表達(dá)增加可抑制 DC在肝癌組織中浸潤;腫瘤直徑越大 VEGF表達(dá)越高;DC浸潤程度與腫瘤直徑負(fù)相關(guān)。鄭海燕等[19]采用免疫組化 SP法檢測 20例胃炎組織及 50例胃癌組織中的 DC和 VEGF。結(jié)果表明胃癌組織中 DC與 VEGF的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),胃癌組織中 DC數(shù)減少、VEGF表達(dá)增多,二者相互作用,促進(jìn)胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移。因此,作者推測 VEGF是通過抑制 DC的分化及功能性成熟,從而導(dǎo)致 DC數(shù)量的減少。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,半枝蓮水提取物具有顯著的抗腫瘤作用,并能夠提高荷瘤小鼠免疫器官的重量,其抗腫瘤機(jī)理可能是通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫力達(dá)到抗腫瘤的效果。半枝蓮提取物能顯著抑制腫瘤組織中 VEGF的表達(dá),抑制其介導(dǎo)的腫瘤血管生成而達(dá)到良好的抑瘤效果;各用藥組瘤組織中的 DC的表達(dá)都有一定程度上的提高,且 DC的表達(dá)與 VEGF呈負(fù)相關(guān)。VEGF是 DC的負(fù)調(diào)控因子,所以試驗(yàn)中 DC表達(dá)水平的提高是半枝蓮提取物的直接作用還是間接作用尚不明確,需要進(jìn)一步深入的研究。

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