朱慕云,姜正華,葛 輝,李 梅,胡茂志

(1.揚州大學臨床醫(yī)學院呼吸科;2.揚州大學實驗中心,江蘇揚州,225001)

三氧化二砷(As2O3)是一種有毒的化合物,但低劑量 As2O3除作為一種有效的中藥治療牛皮癬、梅毒和類風濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病外,近年來的研究表明三氧化二砷具有抗腫瘤作用。本研究探討了三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞株的生長抑制及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

三氧化二砷制劑(伊泰達),由哈爾濱伊達藥業(yè)提供;二甲基亞砜(DMSO)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于上海華美公司;SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞株、RPMI-1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶購于中國科學院上海生物細胞研究所;Annexin V:FITC Apoptosis detection kit及 FACSAria流式細胞儀:均為美國 Beeton Dickinson公司。

細胞培養(yǎng):將 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞株培養(yǎng)于 37℃含 5%CO2溫箱內(nèi),使用 RPMI-1640培養(yǎng)液(含 15%小牛血清,青鏈霉素各 100 U/mL,L-谷氨酰胺200mg/L)培養(yǎng),肺癌細胞呈貼壁生長,2～3 d后用 0.25%胰蛋白酶消化傳代。

實驗分組:實驗共設(shè) 3組,分別為空白組(加培養(yǎng)基 200μL),對照組(單細胞懸液 100μL+培養(yǎng)基 100μL,實驗組(單細胞懸液100μL+處理因素 100μL)。

癌細胞生長抑制率的測定:將消化計數(shù)的單細胞懸液加入 96孔培養(yǎng)板中,調(diào)節(jié)細胞濃度為 1×105個/mL,采用MTT法,每孔加入單細胞懸液100μL,三氧化二砷制劑 100μL,濃度分別為每毫升 0.1 μg、0.4 μg、0.8 μg、1 μg、4 μg及 8μg,置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后,每孔加入 40μL MTT液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后,吸取上清液。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100μL/孔,振蕩 10 min,使 MTT還原產(chǎn)物完全溶解,用ClinBio120型酶標儀,測定每孔光密度值(A570)。腫瘤細胞的生長抑制率(%)=(1-實驗組 A值/對照組 A值)×100%

細胞凋亡的形態(tài)學變化:將消化計數(shù)的單細胞懸液加入 96孔培養(yǎng)板中,調(diào)節(jié)細胞濃度為 1×105個 /mL,每孔加入單細胞懸液 100μL和 1μg濃度的三氧化二砷制劑 100μL。分別在 12、24及 48 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及細胞數(shù)的改變。

細胞凋亡的檢測(Annexin V/PI標記法):將培養(yǎng)至對數(shù)生長的 SPCA/Ⅰ細胞裝入 96孔板,調(diào)節(jié)細胞濃度為 1×105個/孔。隔夜培養(yǎng)后,分別加入終濃度為 0.4、4μg/mL的三氧化二砷制劑。再培養(yǎng) 24 h后收集細胞,離心機 1 500 r/min,離心 5 min并給予冷 PBS洗滌,用 Annexin V:FITC Apoptosis detection kit I進行標記后,避光染色15 min,上流式細胞儀檢測分析。

2 結(jié) 果

2.1 三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞有直接的抗增殖效應(yīng)

將不同濃度的三氧化二砷(分別為 0.1、0.4、0.8、1.0、4.0和 8.0 μg/mL)作用于 SPCA/Ⅰ細胞 24 h后,進行 SPCA/Ⅰ細胞增殖抑制率的中位值檢測,結(jié)果分別為:6.78%、16.34%、37.13%、56.26%、70.32%和 97.55%。見圖 1。

2.2 細胞凋亡的形態(tài)學變化

圖1 不同濃度的三氧化二砷對人肺癌細胞生長的抑制作用

將 1μg/mL的 As2O3作用于 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞,分別在作用 12、24和 48 h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察并攝像,與對照組比較,細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化,表現(xiàn)為細胞胞漿固化,細胞核不規(guī)則,染色質(zhì)濃縮;體積縮小變圓,部分核碎裂,胞質(zhì)和細胞膜分離,出現(xiàn)空泡,細胞裂解等細胞凋亡的特征性改變,并與所作用的時間成正比。

2.3 三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞誘導(dǎo)凋亡的作用

采用Annexin V:FITC Apoptosis detection kit I進行標記、流式細胞儀檢測分析法,將 0.4μg/mL和 4μg/mL濃度的三氧化二砷作用于 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞 24 h后,計算出凋亡陽性細胞百分率分別為 17.8%和 28.6%,與對照組相比(3.3%)有顯著差異(P<0.01)。表明三氧化二砷有誘導(dǎo) SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞凋亡的作用(圖 2)。

結(jié)果判定:在雙變量流式細胞儀的散點圖 Q1-Q4象限上,Q3顯示活細胞(Annexin V-/PI-),Q2象限顯示非活細胞(Annexin V+/PI+),即凋亡晚期繼發(fā)死亡細胞或壞死細胞,右下象限顯示為凋亡細胞(Annexin V+/PI-)。

3 討 論

凋亡是機體消除多余或有潛在危險細胞的生理現(xiàn)象,以維持機體細胞總數(shù)在適當?shù)纳矸秶鷥?nèi)。腫瘤不僅是細胞增殖、分化異常的結(jié)果,同時還是一種細胞凋亡調(diào)控障礙的疾病。凋亡受阻將導(dǎo)致細胞代謝的紊亂及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一個重要因素[1]。惡性腫瘤細胞凋亡的比例明顯下降,如能誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡比例的增加,則有可能抑制惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。

圖2 AnexinV:PI標記檢測三氧化二砷(0.4、4.0μg/mL)對SPCA-1人肺腺癌細胞凋亡的影響

三氧化二砷(As2O3)是一種砷化物,俗稱砒霜,是一種有毒的化合物。但是,小劑量 As2O3具有抗癌活性,臨床治療急性早幼粒細胞白血病(APL)已有近 40年歷史,且已被美國食品和藥物管理局批準用于治療全反式維甲酸(ATRA)耐藥的 APL。近年來應(yīng)用 As2O3治療人類腫瘤性疾病已成為腫瘤治療領(lǐng)域的一大研究熱點,國內(nèi)外的一些研究顯示,三氧化二砷對胃癌、結(jié)腸癌細胞、膀胱癌及喉癌等實體瘤[3-6]也有一定的療效。三氧化二砷抗腫瘤作用的機理,目前認為可能有以下幾個方面:細胞毒作用,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖周期,影響腫瘤血管生成,逆轉(zhuǎn)癌癥細胞耐藥等[6-8]。

本研究初步探討了 As2O3對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞抗增殖效應(yīng)和誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng),并分析了不同時間及不同濃度組 As2O3的作用。結(jié)果表明:不同濃度組的三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞的生長均有一定的抑制作用,其抑制程度和藥物濃度呈正相關(guān)。通過倒置相差顯微鏡發(fā)現(xiàn)癌細胞產(chǎn)生了細胞胞漿固化,細胞核不規(guī)則,染色質(zhì)濃縮;體積縮小變圓,部分核碎裂,胞質(zhì)和細胞膜分離,細胞裂解等細胞凋亡的特征性改變。通過 Annexin V:FITC Apoptosis detection kit I進行標記、流式細胞儀檢測分析,在雙變量流式細胞儀的散點圖上發(fā)現(xiàn)不同濃度組的三氧化二砷對 SPCA/Ⅰ人肺腺癌細胞均有誘導(dǎo)凋亡的作用,并隨著藥物濃度的增加,凋亡率也相應(yīng)增加。

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