董艷紅 李 玲 王秀玲 呂佩源 范鳴玥 許 靜 孟 楠

(河北醫(yī)科大學(xué)研究生院，河北 石家莊 050017)

皮質(zhì)下缺血性腦血管病(subcortical ischemic vascular disease，SIVD)的發(fā)病機制復(fù)雜，其中免疫和炎癥機制參與了慢性腦缺血所致癡呆的過程，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可以對缺血、神經(jīng)變性疾病等產(chǎn)生完整的炎癥反應(yīng)。研究提示，CD40-CD40L是各種免疫與炎癥調(diào)節(jié)的重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。本課題首次通過檢測SIVD患者血清中可溶性CD40配體(soluble CD40 ligand，sCD40L)的水平，了解其變化規(guī)律，進一步從臨床角度探討其與白質(zhì)病變(WML)、認(rèn)知障礙的相關(guān)性，以期能為SIVD尋求更多、更有效的多方位診斷和治療手段提供線索。

1 對象與方法

1.1 對象 SIVD患者來自2009年9月至2010年12月間我院神經(jīng)內(nèi)科門診和住院患者，依據(jù)Erkinjuntti〔1〕提出MRI診斷標(biāo)準(zhǔn)和血管性認(rèn)知功能損害的專家共識〔2〕確定SIVD。正常對照組受試者來自年齡和性別匹配的認(rèn)知功能正常的老年體檢人群。所有受試者均由2位副主任醫(yī)師以上神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師根據(jù)病史、癥狀、神經(jīng)系統(tǒng)檢查、常規(guī)實驗室檢查及頭顱MRI平掃等做出診斷。共入選SIVD患者39例，按照認(rèn)知損害的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為血管性癡呆(VD)組和血管性認(rèn)知障礙非癡呆(vascular cognitive impairment no dementia，VCIND)組。①VD組。參照美國國立神經(jīng)疾患和腦卒中研究所和瑞士神經(jīng)科學(xué)研究國際協(xié)會(NINDS-AIREN)VD 的標(biāo)準(zhǔn)〔3〕和 Wentzel〔4〕提出的 VCI診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合張明園等〔5〕提出簡明精神狀態(tài)檢查(MMSE)癡呆篩選分界值。具體如下:(1)有認(rèn)知功能減退的主訴或有知情人提供的認(rèn)知功能減退;(2)MMSE評分文盲≤17分，小學(xué)≤20分，初中及以上≤24分;(3)認(rèn)知功能量表檢查至少有一個認(rèn)知領(lǐng)域損傷的客觀證據(jù);(4)日常生活能力量表(ADL)評分＞26分;(5)CDR評分≥0.5分。VD患者19例，其中男15例、女4例。②VCIND組。VCIND患者20例，男16例、女4例。納入標(biāo)準(zhǔn)〔6〕:(1)患者有輕度認(rèn)知損害，有知情者證實;(2)一般認(rèn)知功能保留，日常生活能力未受損，ADL評分＜26分，各項認(rèn)知功能評分低于對照組1.5個標(biāo)準(zhǔn)差;(3)未達到美國精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊第四版(DSM-Ⅳ)的癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)，CDR評分為0.5分;(4)認(rèn)知障礙由腦血管病導(dǎo)致。③正常對照(NC)組。正常對照15例，其中男11例，女4例，年齡60～85〔平均(70.67±6.90)〕歲，MMSE評分為(28.13±1.06)分。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)排除皮質(zhì)和(或)皮質(zhì)-皮質(zhì)下非腔隙性梗死和分水嶺梗死、出血、正常顱壓腦積水和其他原因造成的WML(如多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)病、放射性腦病等);(2)排除其他原因所致認(rèn)知損害，如正壓性腦積水、甲狀腺功能障礙、維生素缺乏等;(3)24項Hamilton抑郁量表≥8分;或Hachinski缺血量表評分≤6分;或臨床癡呆分級量表＞2分者;(4)排除失語、偏癱、耳聾等無法完成神經(jīng)心理學(xué)評估者;(5)排除有腦發(fā)育障礙、精神發(fā)育遲滯、近期腦外傷、癲癇、藥物濫用及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病史等;(6)排除存在下列情況之一者:有嚴(yán)重的心、肝、肺、腎等臟器功能不全，急、慢性感染(包括2 w內(nèi)有明確感染史，慢性肝炎急性期或活動期)，自身免疫性疾病，應(yīng)用免疫抑制劑史。

1.3 方法

1.3.1 神經(jīng)心理學(xué)評估 由經(jīng)過專門的神經(jīng)心理學(xué)檢測培訓(xùn)的專職醫(yī)師、應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化語言對每位受試者和家屬進行詳細的神經(jīng)心理測試和臨床訪談，測查MMSE、蒙特利爾認(rèn)知評估量表北京版(MoCA)。檢查結(jié)束后，兩名評定者分別獨立評分，取平均值。

1.3.2 頭MRI掃描 采用美國GE公司生產(chǎn)的3.0T磁共振成像儀(GE SIGNA EXCITEⅡ)對入選患者行頭MRI掃描，常規(guī)軸位T1加權(quán)成像(T1WI)，T2加權(quán)成像(T2WI)，液體衰減反轉(zhuǎn)回復(fù)序列(T2-FLAIR)檢查。

1.3.3 腦WML分級評分 采用Wahlund〔7〕等提出的年齡相關(guān)WML評分方法，將大腦左右半球分別分為額區(qū)、頂枕區(qū)、顳區(qū)、幕下區(qū)和基底節(jié)共10個區(qū)域，根據(jù)WML程度不同，每個區(qū)域按照0～3分的四級標(biāo)準(zhǔn)分別給出評分，總分0～30分。由兩名副主任醫(yī)師分別單獨評分，取其均值作為WML最終評分。見圖1。

1.3.4 sCD40L濃度檢測

1.3.4.1 主要儀器 酶標(biāo)儀:Biotek ELX800型酶標(biāo)儀;離心機:低速臺式自動平衡離心機，型號DT5-6(北京時代北利離心機有限公司)。

1.3.4.2 主要試劑 sCD40L檢測試劑盒:human sCD40L BMS239，由奧地利Bender MedSystemS公司提供，其檢測靈敏度為0.062 ng/ml。

1.3.4.3 標(biāo)本收集 所有受試者過夜禁食12 h后，于次晨空腹肘靜脈采取非抗凝血3～4 ml，自然凝固30 min后常溫3 000 r/min離心10 min，分離血清，－70℃低溫冰箱保存，等待成批酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測。

1.3.4.4 sCD40L濃度檢測 應(yīng)用ELISA法測定血清sCD40L濃度，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，當(dāng)定量資料滿足正態(tài)分布及方差齊時，用方差分析對3組年齡、受教育水平、認(rèn)知評分及sCD40L濃度進行比較，當(dāng)不滿足正態(tài)分布及方差齊時應(yīng)用多個樣本秩和檢驗;性別構(gòu)成應(yīng)用多個樣本率比較的χ2檢驗;采用Spearman相關(guān)分析統(tǒng)計sCD40L濃度與MoCA評分的相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 認(rèn)知測評及sCD40L濃度檢測 SIVD兩組與NC組相比，WML評分和血清sCD40L濃度增高(P＜0.05)。VD組與VCIND組之間比較差異不顯著(P＞0.05)。三組受試者MMSE、MoCA評分比較差別顯著(P＜0.05)。見表1。

表1 三組認(rèn)知功能、WML評分及sCD40L的比較(x±s)

圖1 WML示例圖

2.2 sCD40L濃度與神經(jīng)心理評分、白質(zhì)病變評分的相關(guān)分析 sCD40L 濃度與 MMSE(r=0.210，P=0.213)、MoCA(r=0.322，P=0.055)、WML(r=0.003，P=0.988)評分均無明顯相關(guān)性。

3 討論

近年來發(fā)現(xiàn)的重要炎癥標(biāo)志物CD40/CD40L(CD40配體)是一對互補的跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子超家族成員，為T、B細胞活化提供必需的第二信號，廣泛參與了細胞免疫、體液免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)〔8〕，是免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。sCD40L由CD40L水解而成，主要由活化血小板釋放入血，可進一步激活血小板，促進炎癥反應(yīng)和血栓形成〔9〕。健康人血清中sCD40L低表達，當(dāng)機體出現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)后，sCD40L水平明顯增加。國外研究發(fā)現(xiàn)，VD、阿爾茨海默病(AD)的神經(jīng)病理學(xué)改變均與CD40異常高表達相關(guān)的小膠質(zhì)細胞活化有著密切的關(guān)聯(lián)〔10〕。Deng等〔11〕證實，激活的小膠質(zhì)細胞可以通過有絲分裂原激活蛋白途徑產(chǎn)生炎性細胞因子，對少突膠質(zhì)細胞產(chǎn)生損害作用，導(dǎo)致腦室周圍WML。有學(xué)者提出血漿sCD40是AD細胞分化的生物學(xué)標(biāo)志〔12〕，目前國內(nèi)尚無對于CD40與VD認(rèn)知損害的研究。

本研究結(jié)果提示CD40/CD40L信號通路參與了SIVD的發(fā)生，SIVD的發(fā)病機制中存在著慢性炎性因素。究其原因，二者之間的臨床相關(guān)性與動脈粥樣硬化有著密不可分的聯(lián)系。動脈粥樣硬化可導(dǎo)致腔隙梗死、深穿支小動脈狹窄，造成SIVD的認(rèn)知損害〔13〕。CD40/CD40L作為免疫及炎癥反應(yīng)中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，其相互作用可造成內(nèi)皮細胞損傷，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞等表達一些前炎癥因子，促進細胞因子的合成，上調(diào)細胞表面黏附因子表達，誘導(dǎo)趨化因子的生成，刺激基質(zhì)金屬蛋白酶合成和釋放，引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，因此在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起著極為關(guān)鍵的作用〔14，15〕。在SIVD的發(fā)病機制中，腦微循環(huán)變化有著重要意義〔16〕，內(nèi)皮細胞功能下降影響腦微循環(huán)，造成低灌注、慢性腦缺血，有可能加重VD進展。動物實驗在腦內(nèi)微循環(huán)的內(nèi)皮細胞也發(fā)現(xiàn)了CD40的組成性表達〔17〕。因此sCD40L在SIVD發(fā)展中的作用值得引起重視，下調(diào)CD40/CD40L的相互作用有可能延緩SIVD的發(fā)生。

有研究表明，慢性腦缺血時，由于能量代謝障礙，引起損傷級聯(lián)反應(yīng)，炎性因子如sCD40L等可使小膠質(zhì)細胞活化。激活的小膠質(zhì)細胞能夠分泌大量的炎性介質(zhì)加重炎性反應(yīng)，導(dǎo)致惡性循環(huán)，最終促進神經(jīng)元損傷、髓鞘脫失，造成腦白質(zhì)損傷，加之神經(jīng)元的毒性作用，從而導(dǎo)致認(rèn)知障礙。但本研究中并未發(fā)現(xiàn)血清sCD40L水平與WML明顯相關(guān)，而且VD、VCIND兩組之間的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義。進一步對兩組患者的sCD40L與MMSE、MoCA的相關(guān)分析也顯示SCD40L與總體認(rèn)知功能評分均無相關(guān)性，表明盡管sCD40L可能參與了SIVD的病理變化過程，但由于血腦屏障等因素，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫功能失調(diào)不一定在外周表現(xiàn)出來，外周血清中sCD40L水平并不能完全代表大腦的炎性反應(yīng)狀況，也無法反映SIVD患者認(rèn)知障礙的程度變化。sCD40L濃度的升高也可能與動脈粥樣硬化、危險因素、并發(fā)疾病等有一定關(guān)系，其相關(guān)性有待進一步證實。

1 Erkinjuntti T，Inzitari D，Panton I，et al.Limitations of clinical criteria for the diagnosis of vascular dementia in clinical trials.Is a focus on subcortical vascular dementia a solution〔J〕?Ann NY Acad Sci，2000;903:262-72.

2 血管性認(rèn)識功能損害專家共識組.血管性認(rèn)識功能損害的專家共識〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2007;46:1052-5.

3 Roman GC，Tetemichi TK，Erkinjuntti T，et al.Vascular dementia:diagnostic criteria for research studies.Report of the NINDS-AIREN International Workshop〔J〕.Neurology，1993;43(2):250-60.

4 Wentzel C，Darvesh S，Macknight C，et al.Inter-rater reliability of the diagnosis of vascular cognitive impairment at a memory clinic〔J〕.Neuroepidemiology，2000;19(4):186-93.

5 張明園，瞿光業(yè)，金 華，等.幾種癡呆測試工具的比較〔J〕.中華神經(jīng)精神科雜志，1991;24(2):194-6.

6 Roman GC，Sachdev P，Royall DR，et al.Vascular cognitive disorder:a new diagnostic category updating vascular cognitive impairment and vascular dementia〔J〕.J Neurol Sci，2004;226(1-2):81-7.

7 Wahlund LO，Barkhof F，F(xiàn)azekas F，et al.A new rating scale for age-related white matter changes applicable to MRI and CT〔J〕.Stroke，2001;32(6):1318-22.

8 Schonbeck U，Libby P.The CD40/CD40L receptor/ligand dyad〔J〕.Cell Mol Life Sci，2001;58(1):4-43.

9 Andre P，Prasad KS，Denis CV，et al.CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta 3 integrin-dependent mechansm〔J〕.Nat Med，2002;8(3):247-52.

10 Giunta B，F(xiàn)igueroa KP，Town T，et al.Soluble CD40 ligand in dementia〔J〕.Drugs Future，2009;34(4):333-40.

11 Deng Y，Lu J，Sivakumar V，et al.Amoeboid microglia in the periventricular white matter induce oligodendrocyte damage through expression of proinflammatory cytokines via MAP kinase signaling pathway in hypoxic neonatal rats〔J〕.Brain Pathol，2008;18(3):387-400.

12 Chui HC.Subcortical ischemic vascular dementia〔J〕.Neurol Clin，2007;25(3):717-40.

13 Mocali A，Cedrola S，Della Malva N，et al.Increased plasma levels of soluble CD40，together with the decrease of TGF beta1，as possible differential markers of Alzheimer disease〔J〕.Exp Gerontol，2004;39(10):1555-61.

14 Shibuya H，Nagai T，Ishii A，et al.Differential regulation of Th1 responses and CD154 expression in human CD4+T cells by IFN-alpha〔J〕.Clin Exp Immunol，2003;132(2):216-24.

15 Reinders ME，Sho M，Robertson SW，et al.Proangiogenic function of CD40 ligand-CD40 interactions〔J〕.J Immunol，2003;171(3):1534-41.

16 Kuwabara Y，Ichiya Y，Sasaki M，et al.Time dependency of the acetazolamide effect on cerebral hemodynamics in patients with chronic occlusive cerebral arteries:early steal phenomenon demonstrated by15O-H2O positron emission tomography〔J〕.Stroke，1995;26(10):1825-9.

17 Ishikawa M，Vowinkel T，Karen Y，et al.CD40/CD40 ligand signaling in mouse cerebral microvasculature after focal ischemia/reperfusion〔J〕.Circulation，2005;111(13):1690-6.