孫亞東 馬 彥 楊 樂 (吉林省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林 長春 130021)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)主要與胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能受損有關(guān)。抵抗素作為一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪組織分泌的肽類激素，成為近年來的研究熱點，其功能是對抗胰島素作用，導(dǎo)致機體胰島素抵抗。抵抗素的表達(dá)受多種因素的調(diào)節(jié)，如年齡、性別、營養(yǎng)狀態(tài)、激素、局部因子及藥物等〔1〕。因此本文對抵抗素基因在中國東北地區(qū)老年T2DM患者中進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)進(jìn)行檢測，探討中國東北地區(qū)漢族老年人群中抵抗素基因的多態(tài)性與T2DM的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所有研究對象均來自于我院內(nèi)分泌科2009年3月至11月住院患者及體檢中心健康體檢者，均為中國東北漢族地區(qū)老年人群。T2DM組:115例(男59例，女56例)，年齡60～71〔平均(64.28±6.77)〕歲，體重指數(shù)(23.1±2.81)kg/m2，診斷符合1999世界衛(wèi)生組織(WHO)的診斷標(biāo)準(zhǔn):空腹血糖(FPG)≥7.0 mmo1/L及/或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L，均除外原發(fā)性心肺疾病、腦血管疾病、T2DM大血管并發(fā)癥以及微血管并發(fā)癥。正常對照組:99例(男51例，女48例)，年齡60～70〔平均(63.86±6.23)〕歲，均為本院體檢中心健康體檢者，追問病史、體檢、實驗室及心電圖檢查，排除糖尿病、腦血管疾病、心肺疾病及腎臟疾病等。所有入選者抽外周血5 ml，按酚/氯仿法抽提DNA，并首先隨機選取其中20例T2DM患者DNA作為篩查SNP的樣本。

1.2 方法〔2〕所有入選者抽外周血5 ml，按酚/氯仿法抽提DNA，并首先隨機選取其中20例T2DM患者DNA作為篩查SNP的樣本。

1.2.1 SNP檢測 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在96孔薄壁板中進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包含10 ng人基因組 DNA，10×PCR 緩沖液 2.5 μl，25 mmol/L MgCl22 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，20 μmol/L 引物 0.4 μl/對，5 U/μl TagDNA 酶 0.2 μl。PCR儀為Prkin-Elmer-Cetus9700。PCR反應(yīng)條件為酶激活95℃2 min，94℃變性40 s，退火溫度在起始的10個循環(huán)中為63℃ ～58℃，每次遞減0.5℃，反應(yīng)60 s，延伸72℃ 35 s;在以后的30個循環(huán)中，退火溫度固定為58℃，每次反應(yīng)為40 s，延伸72℃35 s;終末延伸72℃ 10 min。序列測定:PCR擴增的目的片段經(jīng)電泳鑒定、resin(Wizard PCR Preps DNA purification Resin，Promega)純化后，用ABlPRIMERTM，Big-Dye末端標(biāo)記試劑盒(PE，F(xiàn)oster City，CA)，以PCR反應(yīng)的特異引物為測序引物進(jìn)行雙向測序反應(yīng)。測序反應(yīng)條件:96℃變性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，35個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀，ABI377自動測序儀行核苷酸序列測定。并進(jìn)一步用PolyPhred軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，綜合正反雙向序列結(jié)果識別SNP。

1.2.2 SNP的基因分型 對所篩查出的SNP采用直接測序法對所有受試者作進(jìn)一步基因分型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS軟件，計算兩組SNP位點的等位基因頻率，組間差異分析采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 抵抗素多態(tài)性分析 抵抗素基因共測序2 813 bp，共檢出5個SNPs，均在啟動子區(qū)。

2.2 SNP等位基因頻率在T2DM組與正常對照組比較 采用直接測序法在T2DM患者和99例正常對照者間作進(jìn)一步基因分型，結(jié)果表明這些SNP的等位基因頻率在兩組之間均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 抵抗素基因SNPs在T2DM組和正常對照組間等位基因頻率比較(%)

3 討論

T2DM患病率逐年提高，死亡率亦逐年增加，深入探索其發(fā)病機制對于糖尿病血管病變的綜合防治、提高糖尿病患者的生存率和生存質(zhì)量有重要的理論和實踐意義。遺傳因素在其中可能起著相當(dāng)重要的作用，故探討遺傳基因多態(tài)性與T2DM并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系成為近年研究熱門〔3～5〕。

抵抗素與胰島素抵抗、糖尿病、炎癥、動脈粥樣硬化(AS)等病理過程或疾病有關(guān)，但其具體作用還不很明確。人抵抗素基因定位于19p13.3，內(nèi)含子邊界序列均高度保守。其mRNA含476個堿基，迄今僅發(fā)現(xiàn)2種人抵抗素亞型。最近研究表明，抵抗素蛋白晶體具有獨特的多聚體結(jié)構(gòu):每個單體尾端由二硫鍵相連，形成三聚體或四聚體結(jié)構(gòu)，此二硫鍵形成可能是抵抗素活化的必需步驟之一。抵抗素二聚體具有全蛋白80% ～90%的功能，而抵抗素單體僅有全蛋白10% ～20%的功能。抵抗素的裝配與調(diào)節(jié)機制迄今尚不明確，推測可能對二硫鍵的剪切或裝配過程的調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)抵抗素的剪切與裝配〔6〕。

有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病微血管病變患者與單純T2DM病患者的血漿抵抗素水平均顯著高于正常對照組〔7〕。而亦有研究認(rèn)為血清抵抗素可能與T2DM的發(fā)病不相關(guān)〔2〕。本研究采用直接測序法在T2DM和正常對照組間進(jìn)行基因分型及等位基因頻率比較，共檢測5個SNP，結(jié)果顯示在上述兩組東北地區(qū)漢族老年人群中這此SNP的等位基因頻率無顯著性差異，表明抵抗素基因多態(tài)性與東北地區(qū)漢族T2DM老年人群中無顯著相關(guān)性，這可能與研究樣本的數(shù)量、位點的選取及不同種族間的糖尿病易感性及個體差異有關(guān)。

本研究認(rèn)為抵抗素基因多態(tài)性與中國東北地區(qū)漢族人群老年T2DM無顯著相關(guān)性。

1 孫 禎，李希圣.抵抗素與肥胖及2型糖尿病相關(guān)性研究〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2009;15(11):1693-5.

2 董 艷，黃 微，李 果，等.抵抗素基因多態(tài)性與華東地區(qū)2型糖尿病的相關(guān)性〔J〕.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003;23(2):97-9.

3 Patel SD，Rajala MW，Rosseui L，et al.Disulfide-dependent multimeric assembly of resistin family hormones〔J〕.Science，2004;304(5674):1154-8.

4 Arita Y，Kihara S，Ouchi N，et al.Adipocyte-derived plasma protein adiponectin acts as a platelet-derived growth factor-BB-binding protein and regulates growth factor-induced common postreceptor signal in vascular smooth muscle cel〔J〕.Circulation，2002;105(24):2893-8.

5 Qi L，Doria A，Manson JE，et al.Adiponectin genetic variability，plasma adiponectin，and cardiovascular risk in patients with type 2 diabetes〔J〕.Diabetes，2006;55(5):1512-6.

6 徐偉斌，俞 璐，羅 敏.抵抗素的研究進(jìn)展〔J〕.國際內(nèi)分泌代謝雜志，2006;26(1):23-5.

7 莊 瑋，成興波.血漿抵抗素與2型糖尿病及糖尿病微血管病變關(guān)系的研究〔J〕.中國血液流變學(xué)雜志，2006;16(1):101-3.